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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 4 (2016) 105-112

Evaluación de la susceptibilidad in vitro sobre trofozoitos de Giardia lamblia frente a extractos de plantas de la Medicina Tradicional Tacana

CONDO MONTERO, CLAUDIA1 SALAMANCA CAPUSIRI, EFRAÍN1 TICONA, JUAN CARLOS1 MONZÓN, JOSÉ LUIS1

FLORES, NINOSKA1

UDAETA, ENRRIQUE1 SERRATO, ALCIDES2 MARUPA, NATALIO2 GIMÉNEZ TURBA, ALBERTO1

CORRESPONDENCIA: AGIMENEZ@MEGALINK.COM • Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés. Av. Saavedra # 2224, Miraflores. La Paz, Bolivia.

1 Unidad de Evaluaciones biológicas, Área de Química Farmacéutica, Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Facultad de Cien- cias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés. La Paz, Bolivia.

2. Comunidad Buena Vista CIPTA

FECHA DE RECEPCIÓN: 26/02/2015 FECHA DE ACEPTACIÓN: 10/05/2016

Resumen

Giardia lamblia, es el protozoario entéri- co encontrado con mayor frecuencia en exá- menes coproparasitológicos, siendo la prin- cipal causa de enfermedades diarreicas no virales en los humanos en quienes provoca deficiencias nutricionales y deterioro cogni- tivo. Teniendo en cuenta el impacto sobre la salud y dado que esta enfermedad está aso- ciada a la pobreza, la OMS la incluyo dentro de las Enfermedades Desatendidas. Si bien es cierto que existe tratamiento para estas parasitosis, estos no son siempre accesibles en áreas rurales donde la medicina tradicio- nal, científicamente evaluada, puede apoyar en el uso racional haciendo de la medicina tradicional una alternativa en el control de la Giardiasis. Por lo que el presente trabajo rea- lizó la evaluación de la actividad antiparasi-

Abstract

Giardia lamblia, an enteric protozoan is found most often in coproparasitological tests, being the leading cause of parasitic di- arrheal diseases in humans in those causes nutritional deficiencies and cognitive im- pairment. Given the impact on health and since this disease is associated with pover- ty, WHO included within Neglected Diseas- es. While it is true that there is treatment for these parasites, these are not always acces- sible in rural areas where traditional medi- cine, scientifically evaluated, can support the rational use of traditional medicine making an alternative in the control of Giardiasis. So this study conducted an evaluation of the antiparasitic activity of 27 ethanolic extracts of plant species of traditional Tacana med- icine used in cases of diarrhea, these were

taria de 27 extractos etanólicos de especies vegetales de la medicina tradicional Tacana utilizados en casos de diarrea, estos fueron enfrentados in vitro sobre trofozoitos de Giar- dia lamblia, la medición de la IC50 se realizo utilizando el método fluorométrico de resa- zurina (2mM), trabajando a una longitud de excitación y emisión de 540 – 590nm respec- tivamente, con una población parasitaria de 7,5x105 trofozoitos/mL, incubados a 37°C por 48 hrs. De los 27 extractos de la farmacopea Tacana un total de 14 extractos (52%) pre- sentaron IC50 mayor a 200 μg/ml, 11 extrac- tos (40,7%) presentaron valores de IC50 entre 100 y 200 μg/ml y 2 extractos (7%) con valores entre 100 y 50 μg/ml. Teniendo de esta ma- nera al Picantillo jengibre (IC50 de = 64,8±11) y Chuchuhuasi (IC50 de 68±21) como poten- ciales plantas antiparasitarias ya que presen- tan IC50 similares al del extracto de Galipea longiflora (Evanta, IC50=54±9) especie vege- tal utilizada para el tratamiento de parásitos. Estos resultados permitirán a la comunidad Tacana discriminar entre familias de plantas con actividad antiparasitaria in vitro de aque- llas que no presentan dicha propiedad fren- te a posibles parásitos causantes de diarrea.

evaluated in vitro on trophozoites of Giardia lamblia, the measurement of IC50 was per- formed using fluorometric method (resazur- in 2mM), working at a wavelength excitation and emission 540 and 590nm, respective- ly, with a parasitic trophozoites population of 7,5x105/mL, incubated at 37°C for 48hrs. from the 27 extracts of the pharmacopoeia Tacana extracts, a total of 14 (52%) had IC50 greater than 200μg/mL, 11 extracts (40.7%) had IC50 values between 100 and 200 μg/ ml and 2 extracts (7%) with values between 100 and 50μg/ml. Thus having Picantillo gin- ger (IC50 = 64.8 ± 11) and Chuchuhuasi (IC50 of 68 ± 21) as potential antiparasitic plants since they have similar IC50 to extract Galipea longiflora (IC50= 54 ± 9) plant species used for the treatment of parasites. These results allow the Tacana community discriminate between families of plants with antiparasit- ic activity in vitro of those who do not have such property against possible parasites that cause diarrhea.

PALABRAS CLAVE

Giardia lamblia, Susceptibilidad, Concentración Inhibitoria media (IC50), medicina tradicional

Tacana

KEY WORDS

Giardia lamblia Susceptibility, half Inhibitory Concentration (IC50), Tacana traditional

medicine.

INTRODUCCIÓN

Las infecciones parasitarias son uno de los principales problemas de salud pública a nivel mundial especialmente en países en vías de desarrollo debido a la pobreza, causando diarrea, llevando a una deshidratación que puede cau- sar la muerte si no se administra tratamiento a tiempo (Almeida y col., 2007).

Giardia lamblia, es el protozoario entérico encontrado con mayor frecuen- cia en exámenes coproparasitológicos (Thompson, 2008) afecta al intestino del- gado, causando la Giardiasis, existiendo disminución en la retención de gra- sas, dificultando la absorción de algunas vitaminas, ácido fólico, carbohidratos y proteínas (Díaz de la Guardia, 2006; Bussati y col., 2007). A nivel mundial, G. lamblia se ha estimado una frecuencia de 280 millones de individuos infectados, con 500 mil casos nuevos por año (Barrón, 2012). En Bolivia diferentes trabajos

muestran una elevada frecuencia de enteroparásitos (helmintos y protozoarios); Condori y col., 2008, Giménez y col., 2009-2014, Calamani. 2006, constituyén- dose la población infantil, como el sector poblacional más vulnerable.

Para el tratamiento el metronidazol y tinidazol son las drogas de elección, sin embargo, los efectos adversos incluyen problemas gastrointestinales, nau- seas, dolor de cabeza, leucopenia (Tracy y col., 1991). La búsqueda de nuevos tratamientos eficaces con baja toxicidad es muy importante para erradicar el problema, por lo que los estudios de compuestos con propiedades antipara- sitarias a partir de plantas (semillas, hojas o tallos) ha aumentado tales son los estudios hechos a Curcubita pepo (Barrón, 2012), Achyrocline satureioides, Eugenia uniflora, Feoniculum vulgare, Psidiums guajava (Costa y col., 2009), Lippia spp. (Ponce - Macotela y col., 2006), Hovenia dulcis (Gadelha y col., 2005) por lo que la medicina tradicional constituye una alternativa expectan- te sin embargo, pocas especies han sido estudiadas en forma científica y vali- dadas en el laboratorio en nuestro medio.

La comunidad indígena Tacana, pueblo originario de la Amazonia emplea la medicina tradicional para curar males y enfermedades, existen diversos tipos de plantas utilizadas como tratamientos medicinales algunos ejemplos son las plantas del género Euterpe utilizadas para la anemia, en casos de fiebre utilizan plantas como Costus, Brugmansia, Mansoa, Jessenia entre otras, mientras que especies vegetales del género Achyrocline, Zingiber, Carica, Anacardium, Mus- satia son utilizadas cuando existen molestias estomacales e intestinales.

En el presente trabajo se realizó la evaluación de la actividad antiparasita- ria de extractos obtenidos de especies vegetales utilizadas en la medicina tra- dicional Tacana en casos de diarrea sobre trofozoitos de Giardia lamblia, uti- lizando el método fluorométrico de resazurina.

MATERIALES Y MÉTODOS

Medio de Cultivo TYIS-33

El medio de cultivo utilizado en el estudio fue TYIS-33 modificado (pH 7.2), el cual se utilizo para tener poblaciones elevadas de parasitos in vitro, to- mando en cuenta que se trata de parásitos anaerobios facultativos se enraso el medio de cultivo hasta el tope del criotuvo que contenía los trofozoitos de Giardia y se incubaron de 37ºC. Cada 100 ml. de medio de cultivo contiene: 0.1g K2HPO4, 0.06g de KH2PO4, 0.1 g NaCl, 3g Extracto de levadura, 0.05g Bi- lis bovina deshidratada, 1g de glucosa, 0.2g L-cisteina HCl, 0.02g ácido ascór- bico, 2.2mg citrato férrico amónico, suplementado con 15 % de suero bovino fetal (SBF) y 3% de solución de vitaminas (Sigma - Aldrich).

Giardia lamblia y procedimiento de cultivo celular

Los trofozoitos de G. lamblia se obtuvieron por donación de la doctora María Auxiliadora Dea Ayuela, profesora en Farmacia de la Universidad Com-

plutense de Madrid, España (2009). Estos ser mantuvieron en cultivos in vitro

a 37 ºC, con cambios de medio cada 48-72 horas.

Recolección y preparación de extractos crudos de especies vegetales

Las especies vegetales fueron recolectadas alrededor de la comunidad Ta- canade Buena Vista ubicada a 14°22’ 11.65” S y 67°34’01.12” O. a una altura de 214 m.s.n.m. durante los meses de septiembre y octubre del año 2014, pro- vincia Abel Iturralde del departamento de La Paz .

Recolectado el material vegetal, se identifico y posteriormente se dejo secar protegiendo de la luz solar en un ambiente cerrado y seco. Se molió el material y se realizo la maceración en etanol 96% por 48 hrs. A temperatura ambien- te. El extracto fue filtrado, rotaevaporado y llevado a sequedad, obteniéndose de esta manera un total de 27 extractos crudos para la evaluación biológica.

Los extractos se disolvieron en DMSO al 96%, teniendo una concentración madre de 10,000 μg/mL a partir de la cual se prepararon diluciones de 200, 100, 50 y 25 μg/mL. Utilizando como controles CAT (Alcaloides Totales de Ga- lipea longiflora) a concentraciones arriba indicadas, metronidazol (500mg) y tinidazol (1000mg).

Los nombres genéricos y utilidad de las plantas se resumen en la Tabla 1.

Ensayo para la determinación de la Concentración Inhibitoria Media de extractos crudos de las especies vegetales

Se tomó trofozoitos de un cultivo en crecimiento de 48 hrs., llevándolos a una concentración parasitaria de 7.5 x105 trofozoitos/mL, se alicuotó 100 μl en cada pocito de la placa de 96 pozos (Cellstar), a continuación se procedió a añadir 100 μl de las distintas concentraciones de los extractos, vegetales (200- 100-50-25μg/mL) y los controles, medio TIYS-33 modificado como blanco, se incubaron a 37°C por 48 hrs. el CandleJarr con 5% de CO2 , pasado ese tiem- po, se añadió 10 μl de resazurina 2mM en cada pocito y se incubaron a 37°C por 4 hrs. Finalmente se leyó la placa en el lector de fluorescencia( Synergyht BioTek) para determinar la IC50 el cual fue calculado por el programa Gen5.

RESULTADOS

Concentración Inhibitoria Media de extractos de las especies vegetales

Los 27 extractos evaluados corresponden a 15 especies vegetales diferentes, el 67% (10) de las especies, están asociadas a sintomatología relacionada a en- fermedades parasitarias y el 33% han sido seleccionadas con usos tradicionales no asociadas a sintomatología parasitaria (infección urinaria, reumatismo, acné).

Un total de 14 extractos (52%) mostraron valores de IC50 mayor a 200 μg/ ml considerados dentro de nuestro laboratorio como inactivos, 11 extractos (40,7%) presentaron valores de IC50 entre 100 y 200 μg/ml siendo considera- dos como activos, y 2 extractos (7%) son considerados como muy activos ya que presentan IC50 menor a 100 μg/mL. La escala de valores de IC50 utilizada en la clasificación de las especies antiparasitarias es congruente con la opi- nión de otros autores en la selección de plantas antiparasitarias (Amaral y col. 206; Neiva y col. 2014) Los resultados se observan en la tabla 1

Tabla 1. Lista de Plantas, órganos, usos tradicionales, valores de IC50 de los extractos vegetales evaluados

*Antiparasitario convencional utilizado como control positivo

**Control antiparasitario natural (CAT= Alcaloides Totales de Corteza de Evanta-Galipea longiflora)

DISCUSIÓN

De las plantas con usos antiparasitarios el 35% de los extractos (6) fue- ron clasificados como: activos (5) y muy activos (1) demostrando la impor- tancia de trabajar asociados al conocimiento tradicional; al mismo tiempo el extracto más activo corresponde a la especie Zingiber officinale con IC50 de 64,89±11,4 μg/mL utilizada tradicionalmente para tratar la diarrea, de las otras 5 especies 3 son utilizadas para el tratamiento de diarreas, 1 para el do- lor estomacal y 1 en el tratamiento de parásitos protozoarios de Leishmania.

Estos resultados indican de la importancia de la evaluación científica de plantas medicinales asociadas a usos tradicionales ya que el 65% de los ex- tractos de especies utilizadas como antiparasitarias, particularmente en el tratamiento de la diarrea con sangre, en la medicina tradicional Tacana han sido clasificadas como inactivas dentro de nuestro modelo biológico.

De igual manera nuestras evaluaciones en el laboratorio demuestran la pertinencia de llevar adelante evaluaciones biológicas aleatorias de la bio- diversidad de especies vegetales no asociadas a tratamientos de parásitos ya que la especia Chuchuhuasi (Maytenus leavis) con IC50 67,77±21 μg/mL utili- zada tradicionalmente para el reumatismo ha sido catalogada como muy ac- tiva frente al modelo de Giardia lamblia.

La selección de la especie Picantillo dentro de las especies muy activas esta en concordancia con otros estudios realizados sobre la especia Z. officinale por Mahmoud y col. 2014, quien confirma el efecto antiparasitario de extractos de dicha planta a dosis de 10 y 20mg/kg/día por 7 días, evaluando los quistes pre- sentes en las heces, donde el recuento intestinal de trofozoitos, revisando la histopatología y haciendo exámenes microscópicos de la mucosa intestinal, se encontró una disminución en las lesiones e infección parasitaria. Z. officinale (Jengibre) es una planta medicinal utilizada ampliamente en diferentes cultu- ras alrededor del mundo, las principales acciones farmacológicas del jengibre y sus compuestos aislados incluyen acciones de inmunomodulación, antiinfla- matorias, anti apoptoticas, antihiperglicemiantes, antilipidémicas y antiemé- ticas. También es conocido por ser un buen antioxidante pudiendo mitigar o prevenir la generación de radicales libres (Bradeldin y col., 2007).

Por otra parte, Maytenus laevis conocida en los pueblos Tacana como Chuchuhuasi, pertenece a la familia Celastraceae, estudios relacionados a los géneros de esta familia presentan varias aplicaciones biológicas, entre ellas actividad antioxidante, algunas especies sirven para tratar infecciones e infla- maciones, otras muestran actividad analgésica y antiulcerosa, al mismo tiem- po que reportan actividad antiplasmódica (Fonseca y col., 2009; Estevam y col., 2009), el género Maytenus presenta actividad antimicrobiana in vitro contra Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Ba- cillus cereus y Candida albicans (Rodrigues y col., 2012). Alvares y col. el 2014 demuestra que el género Maytenus imbricata posee actividad contra Tricho- mona vaginalis con una IC50 mayor a 34 μg/mL y menor a 68 μg/mL, tomando

en cuenta que T. vaginalis es un protozoario al igual que G. lamblia, y dado los estudios realizados a esta especie vegetal contaríamos con un especie vege- tal prometedora e interesante para futuros estudios.

Este es un primer reporte que demuestra la eficacia de Chuchuhuasi (Ma- ytenus laevis) y Jengibre (Zingiber officinale) contra este protozoario patóge- no anaerobio facultativo, por lo que sería recomendable realizar un estudio biodirigido de estas dos especies así como las otras 5 especies vegetales que presentaron actividad antiparasitaria y así poder identificar el compuesto res- ponsable de esta actividad, ofreciendo finalmente una opción alternativa de origen natural para el tratamiento de la Giardiasis.

Finalmente este tipo de trabajos permite que la comunidad Tacana discri- mine entre familias de plantas con actividad antiparasitaria in vitro de aque- llas que no presentan dicha propiedad frente a posibles parásitos causantes de diarrea.

AGRADECIMIENTOS

El trabajo se realizó gracias a los proyectos: “Validación de la Farmacopea Tacana frente a trofozoitos de Giardia spp” y “Biomoléculas (antiparasitarios)” financiado por el programa de la cooperación Sueca en Bolivia UMSA-ASDI, realizado en los laboratorios de la Unidad de Evaluaciones Biológicas del área de Química Farmacéutica del Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquími- cas de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas.

Al CIPTA su colaboración y permisos para la documentación de usos tradi- cionales y colecta de especies vegetales de uso tradicional Tacana.

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