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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 4 (2016) 93-103
Identificación genética del agente causal y el insecto vector de la enfermedad de chagas circulante
en la amazonía boliviana: Provincia Iturralde
BUITRAGO ROMERO, ROSIO1 BRENIÉRE SIMONE, FRÉDÉRIQUE2
TABORGA MANRIQUE, XIMENA1
QUISPE ARUHUITO, RICHARD1
REVOLLO ZEPITA, SUSANA1
CORRESPONDENCIA: VIRZOTAU@YAHOO.COM
1 Laboratorio de Genética Molecular, Instituto SELADIS, Fac. Cs. Farmacéuticas y Bioquímicas, UMSA
2. Institut de Recherche pour le Développement (IDR), Francia
FECHA DE RECEPCIÓN: 29/02/2016 FECHA DE ACEPTACIÓN: 9/05/2016
Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas, la misma que representa una grave amenaza para la salud en las Américas, con 8 a 9 millones de per- sonas infectadas y 25 a 90 millones en ries- go (Schmunis y Yadon, 2010; WHO, 2008). Este parasito pertenece a la familia Trypa- nosomatidae, y es transmitida por insectos hematófagos pertenecientes a tres géneros (Triatoma, Rhodnius y Panstrongylus).
Abstract
Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease, is a serious threat to health in the Americas, accounting for the highest dis- ease burden in Latin American, with eight to nine million people infected and 25–90 million at risk (Schmunis and Yadon, 2010; WHO, 2008). This parasite, which belongs to the Trypanosomatidae family, is mainly transmitted by blood-sucking bug vectors, belonging to three genera (Triatoma, Rhod- nius, and Panstrongylus).
In Bolivia the geographical distribution of the genera Rhodnius and its roll in the T. cruzi transmission is not clear, because erroneous identifications were realised based only on morphological methods In the present work the molecular technology has been introduced in order to identify the insect vector as the transmitting agent of the disease of Chagas.
A total of fifteen Triatomines were cap- tured in wild regions of the “Municipios San Buenaventura” and “Ixiamas” from 82 palms trees using 4 by each palm. Of the fifteen Triatomines collected only ten were used for the species identification and five of them were infected by Trypanosoma cruzi.
The identification of the philogeny of specimens of Triatomines was performed by analysis of genes of cytochrome B “cyt b” of the mitocondrial DNA and nuclear gene D2, corresponding to the region 28S of the RNA. At the same time DTU identification of isolates of Trypanosoma cruzi by Multiplex PCR tech- nique miniexon (MMPCR) it was performed.
The results allowed to reveal that all the specimens from San Buenaventura, belong to the species Rhodnius stali (SB3, SB4, SB5 and SB6), whereas, of eight specimens from Ixiamas, four belong to the species Rhodnius stali (IX3, IX4, IX6, IX8), and two to the spe- cies Rhodnius robustus (IX2, IX5), based on the analysis of the mitocondrial DNA cyt b, confirming these finding with the analysis of the gene D2. Also, the DTU Tcl Trypanosoma cruzi was identified circulating in this region. These results confirm some morpho- metric studies identifying the species of Rhodnius and they show the DTU “Tcl” of Trypanosoma cruzi that is circulating in the
Bolivian Amazon.
Enfermedad de Chagas, Rhodnius, Amazonia boliviana
KEY WORDS
Chagas disease, Rhodnius, Bolivian Amazon
La Enfermedad de Chagas, es producida por Trypanosoma cruzi, un pro- tozoario flagelado de la familia Trypanosomatidae, y transmitida por insectos hematófagos pertenecientes a los géneros Triatoma, Rhodnius y Panstron- gylus, que viven en ecosistemas diversos (WHO, 2007; Hotez y col., 2008; Sch-
munis y Yadon, 2010). Es considerada un problema de salud pública dada su magnitud y trascendencia, siendo una de las enfermedades transmisibles de más amplia distribución en el continente americano (Silveira, 2007).
El parásito causal se presenta en una gran variedad de cepas e infecta 150 especies de 24 familias de animales domésticos y silvestres, siendo la infec- ción en el hombre de carácter accidental (Guhl, 2009). Al igual que en mu- chas otras enfermedades metaxénicas, la principal vía de transmisión es la vectorial, en la que interactúan el parásito, el vector y el ser humano, y en la que además desempeña un papel importante, un conjunto de condicio- nes ambientales y sociales que permitan este encuentro Briceño-León, 2009). Sin embargo, se han descrito otras formas de transmisión, entre las que se encuentran la transfusional, la congénita, por trasplante de órganos, por ac- cidentes laborales y, más recientemente, la controversial transmisión oral (Guhl, 2009).
Se ha indicado que la enfermedad de Chagas se encuentra presente en todo el territorio del continente Suramericano y gran parte de Centroaméri- ca, representando una grave amenaza para la salud de los países de la región (Guhl, 2009). La Organización Mundial de la Salud (OMS, 2012) calcula que a nivel mundial alrededor de 10 millones de personas están infectadas, princi- palmente en América Latina, donde la enfermedad es endémica; además re- fiere que más de 25 millones de personas están en riesgo de adquirir la enfer- medad, indicando que en 2008, 10.000 personas murieron por esta causa y en ese sentido, la Organización Panamericana de la Salud refirió que a lo largo de 21 países, existían 7’694.500 infectados para 2005, representando una pre- valencia de 1.448% (OMS-2, 2012), sin embargo, no se cuenta con informa- ción más reciente que refleje la verdadera magnitud del problema en zonas nuevas afectadas por estos insectos como la Amazonia.
El rol de los insectos transmisores de esta enfermedad en la Amazonia Bo- liviana es poco conocida debido a que los investigadores, epidemiólogos y las medidas de control han sido focalizadas hasta ahora sobre Triatoma infes- tans, el mayor vector de la región Andina de este país. Se ha reportado que in- sectos del género Rhodnius los principales involucrados en la transmisión de Trypanosoma cruzi en la Amazonia. La importancia epidemiológica de Rhod- nius está relacionada a una fuerte tendencia a la domesticación pero también a la capacidad de entrar esporádicamente a las casas sin colonizarlas. Una ca- racterización es necesaria para establecer que especies podrían estar involu- cradas, más aún si ya se tiene un reporte de transmisión oral de la enferme- dad de Chagas en la región Amazónica de Bolivia por estos insectos (Santalla y col., 2010).
Con el fin de describir atributos genéticos en especies del Género Rhod- nius los mismos que pueden distinguir variaciones mínimas de especie, reali- zamos estudios genéticos basados en el análisis de genes de citocromo B “cyt b” del DNA mitocondrial y genes D2, región 28S del RNA. Nuestros resultados han permitido identificar las especies del Género Rhodnius que están circu- lando en la Amazonía Boliviana.
Por otra parte, entre los marcadores genéticos que pueden identificar los diferentes grupos de T. cruzi previamente descritos están los que discriminan TcI, TcII y TcIV de T. cruzi usando la técnica de Multiplex PCR del Miniexon (MMPCR) (Fernandes y col., 2001. Recientemente, el análisis de MMPCR fue aplicado a un gran muestreo de cepas (caracterizadas previamente por tipi- ficación multilocus) perteneciendo a seis DTUs, mostrando 3 tamaños preci- sos de amplificación: a 200 pb los productos de PCR para TcI, a 250 pb para TcII, a 200 pb para TcI, TcII, TcV y TcVI y a 150 pb para TcIII y TcIV (Bosseno y col., 1996). Este método fue exitosamente aplicado en la identificación de rápida de DTU en el aparato digestivo de triatomineos (Bosseno y col., 2009; Bosseno y col., 2006).
En este trabajo se ha caracterizado genéticamente a especies del género Rhodnius recolectados en una región amazónica de Bolivia y se ha estable- cido su rol en la trasmisión de T. cruzi, identificando además la identidad del parasito por la técnica MMPCR para la caracterización de los DTUs de T. cruzi directamente en el aparato digestivo de los insectos triatominos recolectados en el área de trabajo. Asimismo, se ha realizado la búsqueda de casos huma- nos autóctonos infectados por Trypanosoma cruzi usando métodos serológi- cos y moleculares, estableciendo la prevalencia de la enfermedad y contribu- yendo al conocimiento del nuevo paradigma de la Enfermedad de Chagas en la Amazonia Boliviana.
Un total de quince Triatominos fueron capturados en regiones silvestres de los Municipios de San Buenaventura e Ixiamas de octubre a noviembre de 2014. Las recolecciones fueron realizadas usando trampas adhesivas con car- nada de ratón (Noireau y col., 1999) en ecótopos propios de la Amazonia “co- pas de las palmeras”. El colocado de trampas se hizo en 82 palmeras utilizan- do 4 por cada palmera. Antes de la disección, las heces de cada insecto fueron examinadas en busca de la presencia de Trypanosomatides por observación directa al microscopio a una ampliación de X400. Los insectos luego fueron disecados bajo una campana de bioseguridad y los aparatos digestivos fue- ron almacenados a −20°C.
El DNA genómico fue obtenido a partir de las patas de los insectos adultos y de estadios N3, N4 y N5 e insecto entero en los estadios N1 y N2. Estas es- tructuras del insecto fueron previamente lavadas con buffer PBS (Phosphated Buffered Saline) para evitar contaminación y posteriormente fueron criofrac- turadas según el método reportado por García y col., 1998. Con el sedimento obtenido se realizó la extracción del DNA por el mini kit QIAamp (Quiagen, Courtaboeuf, France) y el producto final fue resuspendido en 40 μL de solu- ción de rehidratación (Miller y col., 1988).
Para cada espécimen, fragmentos de 682-bp del gen “cytochrome B” (cyt b) del DNA mitocondrial fue amplificado por PCR, usando los primers: CYTB7432 (5'-GGACGWGGWATTTATTATGGATC-3') y CYTB7433 (5'-GCWC-
CAATTCARGTTARTAA-3') (Lyman, 1999). Las reacciones de PCR para este gen mitocondrial fueron llevados a un volumen final de 35 μl usando 30-ng de DNA, 1X PCR buffer (0.1 M Tris–HCl, 0.5 M KCl, y 0.015 M MgCl2, pH 8.3),
250- μM dNTP, 0.016-μM de cada primer, 35-mM MgCl2 y 2 U of Taq DNA po- limerasa. Los fragmentos fueron amplificados en el Termociclador Verity de Applied Biosystem con el siguiente programa termal: 94°C por 5 min; 35 ci- clos de 94°C por 30 s, 55°C por 30 s, y 72°C por 30 s; 72°C por 10 min.
Para D2, región variable del gen 28S rDNA (D2-28S) del DNA nuclear, un fragmento de 434-bp fue amplificado por PCR usando los primers D2F (5'-GCGAGTCGTGTTGCTTGATAGTGCAG-3') y D2R, (5'-TTGGTCCGTGTTT-
CAAGACGGG-3') (Porter y Collins, 1996). Las reacciones de PCR fueron lle- vados a un volumen final 35 μl usando 30-ng de DNA, 1X PCR buffer (0.1 M Tris–HCl, 0.5 M KCl, y 0.015 M MgCl2, pH 8.3), 250- μM dNTP, 0.025-μM de
cada primer, 3-mM MgCl2 y 2 U de Taq DNA polimerasa. Después de una de- naturación inicial de 94°C por 5 min, las reacciones de PCR se llevaron a cabo en 35 ciclos a 94°C por 30 s, 60°C por 30 s, y 72°C por 30 s, seguido de una ex- tensión final de 72°C por 5 min (Herrera-Aguilar, 2009). Los amplicones fue- ron enviados al Institute de Recherche pour le Dévelopment (IRD) de Mont- pellier, Francia, para ser purificados y secuenciados en ambas direcciones.
De los diez Triatominos vivos, cinco estaban infectados por Trypanosoma cruzi. El DNA de T. cruzi fue aislado a partir del tracto digestivo de los triato- minos con el mini kit QIAamp (Quiagen, Courtaboeuf, France), de acuerdo a protocolos de muestras desangre. Tres “primers” derivados de regiones repe- titivas hipervariables del mini-exon de T. cruzi y un “primer” común opuesto correspondiente a la secuencia presente en la región conservada del gen mi- ni-exon, fueron utilizados en la reacción de Multiplex PCR. Las condiciones de PCR estuvieron basadas en las descritas por Fernandes y col., 2001), con pequeñas modificaciones. El DNA fue amplificado en 25 ul de volumen de reacción conteniendo 1X de buffer de la reacción, 1.5 mM MgCl2, 50 μM de cada nucleótido, 0.2 μM de cada “primer”, 0.5 UI de Taq polimerasa. La ampli- ficación fue realizada en un termociclador (Verity de Applied Biosystem) en condiciones previamente descritas (Fernandes y col., 2001). Los productos de PCR fueron separados en un gel de agarosa al 1.5% usando patrones de peso molecular (Eurogentec, Angers, France) y visualizado bajo luz ultravioleta con Ez-vision (Amresco, Solon, OH, USA). La discriminación entre DTUs fue reali- zada de acuerdo a Aliaga y col., 2011.
Todas las secuencias obtenidas fueron analizadas con el GenBank. Los ali- neamientos fueron hechos usando el software Bioedit 7.0.5 (Hall, 1999). Di-
versos datos de patrones de referencia del Género Rhodnius fueron incluidos en el análisis filogenético. Las distancias genéticas entre los especímenes es- tudiados fueron estimados para los genes D2 – 28S y cyt b basados en el mo- delo de sustitución de K 2-p (Kimura,1980) como es reportado para especies emparentadas del Género Rhodnius, usando el software MEGA 6 (Tamura y col., 2011).
Nueve especímenes fueron capturados de Palmeras de zonas silvestres del Municipio de Ixiamas (IX1, IX2, IX3,IX4, IX5, IX6, IX7, IX8 e IX9) y seis especí- menes de palmeras ubicadas en los alrededores del Municipio de San Buena- ventura (SB1, SB2, SB3, SB4, SB5 y SB6). De los nueve especímenes de Ixiamas, seis fueron sometidos al análisis genético (IX2, IX3, IX4, IX5, IX6, IX8), mien- tras que, de los seis especímenes capturados en San Buenaventura solo cua- tro fueron analizados (SB3, SB4, SB5 y SB6).
El análisis del DNA mitocondrial a través de las secuencias de citocromo B de las muestras analizadas con el GenBank, ha permitido revelar que todos los especímenes provenientes de San Buenaventura, pertenecen a la especie Rhodnius stali (SB3, SB4, SB5 y SB6), mientras que, de los ocho especímenes provenientes de Ixiamas, cuatro pertenecen a la especie Rhodnius stali (IX3, IX4, IX6, IX8), y dos a la especie Rhodnius robustus (IX2, IX5), como se puede ver en el árbol filogenético basado en este gen (Figura 1).
Realizado el análisis de los genes D2, correspondiente a la región 28S del RNA con el GenBank, se ha podido confirmar que los dos especímenes que estaban integrados en la rama de la especie Rhodnius robustus bajo el análi- sis del gen de citocromo B, lo están también bajo el análisis del gen D2 (IX2, IX5). Sin embargo, los especímenes provenientes tanto del Municipio de Ixia- mas como de San Buenaventura bajo el análisis del gen D2, se integran más en la rama de la especie Rhodnius pictipes, siendo esta una especie muy cer- cana a Rhodnius stali, como se puede evidenciar en el árbol filogenético ba- sado en este gen (Figura 2).
Un total de 5 muestras de DNA provenientes del tracto digestivo de Tria- tominos fueron procesadas por Multiplex PCR (MMPCR). La identificación de tres DTUs de Trypanosoma cruzi fueron evaluados, determinados por el peso molecular de los productos del PCR (a 200 pb los productos de PCR para TcI, a 250 pb para TcII y a 150 pb para TcIII y TcIV). Los resultados evidencian de los cinco especímenes de Triatominos infectados, todos portaban la cepa TcI. (producto de PCR de 200 bp) Foto 1.
Figura 1: Árbol filogenético de especies del Género Rhodnius estructurado sobre la base del análisis de genes del citocromo B del DNA mitocondrial. Las muestras IX2_CYTB y IX5_CYTB se ramifican en la rama de la especie Rhodnius robustus. Las muestras IX3_CYTB, SB6_CYTB, IX4_CYTB, IX6_CYTB, IX8_ CYTB, SB3_CYTB, SB04_CYTB y SB5_CYTB se ramifican en la rama de la especie Rhodnius Stali.
Figura 2: Árbol filogenético de especies del Género Rhodnius estructurado sobre la base del análisis de genes D2 correspondiente a la región 28S del RNAl. Las muestras IX2_D2 y IX5_D2 se ramifican en la rama de la especie Rhodnius robustus. Las muestras SB6_D2, IX4_D2, SB4_D2 y SB5_D2 se ramifican en la rama de la especie Rhodnius pictipes.
Foto 1: Caracterización genética de Trypanosoma cruzi: Carriles 1 y 2 aislados de T. cruzi de insectos capturados; Carril 3 cepa de referencia DTU TcII (250 pb); Carril 4 cepa de referencia DTU TcI (200pb); Carril 5 cepa de referencia DTU TcVI (150pb); Carril 6: Patrón de Peso Molecular.
500pb 300pb 200pb
100pb
Carril 1 Carril 2 Carril 3 Carril 4 Carril 5 Carril 6
El Género Rhodnius incluye 16 especies cuya distribución geográfica es des- de el norte de la Argentina hasta América Central con mayor riqueza de espe- cies en la Amazonía. La importancia epidemiológica de este Género no está relacionada a una vigorosa domesticación de especies como R. prolixus. Varias especies sinantrópicas esporádicamente colonizan el hábitat humano, mientras que otras entran a las casas donde pueden entrar en contacto con humanos y por lo tanto transmitir T. cruzi (Abad-Franch y col., 2010). En Colombia, Ve- nezuela y América Central, los principales vectores de la enfermedad de Cha- gas son del Género Rhodnius (R. prolixus, R. pallescens) bien representados en la región de la Amazonía. En la Amazonía boliviana la distribución geográ- fica de Rhodnius y su rol en la transmisión de T. cruzi no está clara, especial- mente porque hubo identificaciones erróneas realizadas en estudios anterio- res donde especies de R. prolixus fueron registrados incorrectamente debido a la confusión con R. Robustus basados en métodos morfológicos. Monteiro y col., 2003, reportaron en un estudio de filogeografia molecular, la presen- cia de vectores del Género Rhodnius presentes en la Amazonia de países lati- noamericanos agrupando a los mismos en cinco “clades”, uno representando a Rhodnius prolixus y cuatro a Rhodnius robustus, manifiestan además que, mientras la diversidad de R. Prolixus es mas homogénea, la de R. Robustus es más dispersa y apoyado en el análisis del gen nuclear D2 (región del 28S de
RNA) esta especie agrupa a una mayor variedad de especímenes del género Rhodnius. Estos datos apoyan que R. Robustus representa a un gran comple- jo de especies. Nuestros resultados, permitieron identificar dos especímenes dentro del complejo Rhodnius robustus (IX2, IX5) (Figura 1 y 2), apoyados en el análisis del ADN mitocondrial Cyt b y gen nuclear D2, resultados que con- firman la distribución dispersa que reporta Monteiro y col., 2003.
Asimismo, la identificación genética de especies de Rhodnius stali confir- ma su distribución en la Amazonia boliviana como especie exclusiva de esta área. Nuestro estudio pudo detectar ocho especímenes (SB3, SB4, SB5, SB6, IX3, IX4, IX6, IX8) dentro del complejo R. stali apoyados en el análisis del ADN mitocondrial Cyt b, no obstante que, los resultados con el gen D2 en nuestro árbol filogenético no muestra la presencia de R. stali, debido a que pocos es- tudios genéticos han sido realizados a la fecha sobre especies circulantes en la Amazonia boliviana con estos marcadores y como consecuencia la base de datos del GenBank no incluye nuestra diversidad.
Estudios morfométricos en años pasados han demostrado la presencia de las especies R. stali y R. robustus en Bolivia (Justi, 2009, Matias y col., 2003), sin embargo, información epidemiológica acerca de R. robustus falta realizar como lo indica Matias y col., 2001, puesto que la dispersión es bastante am- plia según reporte de Monteiro y col., 2003 quienes sugieren que esta especie pasó a través de un embotellamiento reciente y fue dispersada posteriormen- te por el hombre, conduciendo a que los niveles de divergencia secuencial en- tre clades dentro de cada región son compatibles con el origen Pleistocene.
Por otra parte, la diversidad genética de Trypanosoma cruzi en las zonas en- démicas de territorio boliviano es bastante grande. De acuerdo a la ultima cla- sificación por DTUs, en Bolivia se reporta con mayor porcentaje (98,3%) el DTU TcI (producto PCR de 200 pb) mientras que los DTUs TcII, TcV, o TcVI (producto PCR de 250 pb) y DTUs TcIII yTcIV (producto PCR de 150 pb) solo se encontró una cepa y tres cepas, respectivamente (Breniere y col., 2012). Nuestro estudio permitió detectar la presencia del DTU TcI en los cinco aislados recolectado del Municipio de Ixiamas y el Municipio de San Buena ventura representando este encuentro en una parte del territorio de la Amazonia boliviana, confirmando esa gran dispersión de esta cepa en nuestro país. Sin embargo, deben realizarse mas estudios en otras regiones de la Amazonia que confirmen la presencia de los diversos DTUs que pudieran estar en estas regiones amazónicas.
Triatoma infestans vectors shows a high 305.
