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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 4 (2016) 87-92
Relación de los polimorfismos Na1 y Na2 del receptor FcɣRiiib con lupus eritematoso sistémico en pacientes bolivianos
YANARICO, JUAN GONZALO1 LUNA, MARÍA JULIETA1 SOSA, LUIS FERNANDO1
TERÁN, MARÍA DE LOS ÁNGELES2 PLATA, RAÚL3
CORRESPONDENCIA: FERSOSAT@YAHOO.ES
Laboratorio de Histocompatibilidad e Inmunogenética. Instituto SELADIS-FCFB-UMSA.
Facultad de Medicina-UMSA. Departamento de Medicina. Cátedra de Medicina III Capítulo de Nefrología
Instituto de Nefrología BOL SRL
FECHA DE RECEPCIÓN: 01/03/2016 FECHA DE ACEPTACIÓN: 10/05/2016
Abstract
Fcɣ Receptors for the crystallizable frag- ment "Fc" of immunoglobulin class G ( IgG) are the bridge between the humoral and cel- lular immune response, these receptors are di- vided into: FcɣRIA, FcɣRIB; FcɣRIIA, FcɣRIIB; FcɣRIIIA, FcɣRIIIB. FcɣRIIIB receptor has bialilic codominant polymorphism that is expressed in neutrophils and is called Neutrophilic An- tigen (NA), which has two variants NA1 and NA2. They have been identified in different studies as genetic factors that influence sus- ceptibility to Systemic Lupus Erythematosus (SLE) or lupus nephritis (NL). There is a differ- ence in binding capacities to the Fc portion of IgG by NA1 NA2 alleles, that may be asso- ciated with the inefficient removal of apop- totic cells and immune complexes. This study tried to establish the existence of genetic poly- morfism association between NA1 and NA2 FcɣRIIIB polymorphism with the susceptibility to SLE and NL. 134 SLE patients and 150 healthy controls were studied. All participants gave the informed consent to participate in the study.
The FcɣRIIIB polymorphism was determined by PCR, using allele-specific primers. The re- sults allowed to observe that the frequencies of the NA1/NA1, NA1/NA2 and NA2/NA2 gen- otypes are 0.57, 0.39 and 0.04 for the control
group; and 0.20, 0.73, 0.07 respectively for SLE patients. The SLE patients showed a predomi- nant of genotype NA1/NA2, being the NA2 al- lele a risk factor for SLE. The NA/NA1 geno- type showed statistically significant association to NL risk (Odds ratio 2.52, p<0.001). We con- clude that individuals carrying the NA1/NA2 genotype or carrying the NA2 allele are more likely to develop SLE and lupus patient when carrying the NA1/NA1 genotype are more like- ly to trigger NL.
KEY WORDS
Systemic Lupus Erythematosus, Polymorphism, FCƔRIIIB Receptors, Autoimmunity.
El LES es una enfermedad autoinmune multisistémica inflamatoria carac- terizada por una autoreactividad descontrolada de los linfocitos B (LB) y lin- focitos T (LT) que favorece la producción de auto-anticuerpos contra dife- rentes componentes nucleares y la destrucción de los tejidos. (Cuchacovich y col. 2009). El daño tisular y la inflamación de los vasos sanguíneos (vasculi- tis) son originados por el depósito de complejos inmunes (complejo: Antíge- no-anticuerpo-complemento), los cuales son responsables de la generación del daño sistémico característico de la enfermedad (Wakeland y col., 2001).
El LES se presenta con mayor frecuencia en mujeres y poblaciones con des- cendencia negra (Cervera y col. 2003), particularmente en mujeres de raza ne- gra con edades entre 18 a 65 años, en las cuales se observa una prevalencia de
408.2 personas de cada 100000 habitantes (Fessel, 1974: Mulherin y col., 1993).
Se ha demostrado la existencia de varios factores predisponentes a la en- fermedad, como ser: genéticos, ambientales, infecciosos, hormonales y de- ficiencia en la capacidad regulación de la activación de linfocitos (Cuchaco- vich y col., 2009). Entre los factores genéticos asociados con la susceptibilidad a LES están considerados los polimorfismos alélicos y genotípicos de los re- ceptores para la fracción cristalizable de las IgG (FcɣRs). Estos receptores son glicoproteínas que se unen al Fc de las IgG. Los FcɣRs tienen diferentes ca- pacidades de anclaje al Fc de las IgG, característica que se relaciona con la
susceptibilidad a LES (Salmon y col. 1989; González-Escribano y col. 2002). Un polimorfismo al que los investigadores le han prestado mucho interés es el polimorfismo de los alelos que codifican los Antígenos NA1 y NA2 del FcɣRIIIB; del cual existen diversos estudios en diferentes grupos poblaciona- les que relacionan ya sea el alelo NA1 o al alelo NA2 como factor de suscep- tibilidad a LES. En Bolivia no se cuenta con estudios en el campo de la inmu- nogenética que busquen asociaciones entre los alelos de riesgo descritos en la bibliografía internacional y su asociación o riesgo probable al LES. Como aporte al mejor entendimiento de la enfermedad en nuestros pacientes, el presente trabajo se propuso determinar si en población mixta boliviana de pacientes con lupus el polimorfismo NA1 y NA2 del FcɣRIIIB tiene alguna im- plicación en la susceptibilidad o protección de la enfermedad.
Se incluyeron en el estudio 134 pacientes diagnosticados con LES por clí- nica y laboratorio, 150 individuos control que no manifestaron síntomas pro- pios de la enfermedad, que no tenían antecedentes familiares de LES u otras enfermedades autoinmunes los cuales fueron considerados como grupo con- trol. Todos los participantes asistieron al Instituto SELADIS entre los meses de agosto 2013 a agosto del 2014. El número de casos y control involucrados en el estudio fue elegido por conveniencia, estando en función al número de pa- cientes que se atendieron en el periodo de tiempo que se realizó el estudio, recursos económicos del laboratorio para realizar las pruebas y criterios de selección de los participantes. Todos los individuos que formaron parte del presente estudio fueron informados acerca de los objetivos, alcance y de las posibles complicaciones que puedan resultar de la toma de muestra, para lo cual se obtuvo su consentimiento informado.
Se incluyó a pacientes de cualquier grupo etario y genero con diagnósti- co de LES, con o sin nefropatía lúpica. Como grupo control se incluyó perso- nas sin la enfermedad que dieron serología negativa para LES y otras enfer- medades autoinmunes.
Se excluyeron del estudio a mujeres embarazadas. Pacientes que presenta- ron otra patología autoinmune diferente a LES. Se eliminaron a todos los su- jetos incluidos en el estudio que de manera voluntaria decidieron abandonar el estudio. Individuos que accedieron al estudio y firmaron el consentimiento informado, pero no asistieron a la toma de muestra para el estudio genético.
A los participantes del estudio, se les tomó 5ml de sangre venosa en tu- bos Vaccutainer anticoagulados con EDTA.3K. A partir del paquete globular se
aisló el ADN, y con el plasma se determinaron los biomarcadores serológicos propios del LES (Anticuerpos antinucleares y anti ADN de doble cadena), que permitieron catalogar a los pacientes como caso o control.
A partir de la sangre venosa tomada, se realizó el aislamiento del ADN del paciente mediante el protocolo de obtención del ADN optimizado en el la- boratorio de Histocompatibilidad e Inmunogenética del Instituto SELADIS (Sosa 2007) que se basa en el uso del kit comercial Wizard Genomic DNA purification (Promega, USA). El ADN obtenido fue guardado a -20ºC hasta el momento de su uso.
La tipificación genética del receptor FcɣRIIIB para los alelos NA1 y NA2 del gen FcɣRIIIB se realizo en base a los protocolos de Hong y col. (2005) y Prad- han y col. (2010). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó con cebadores alelo-específicos para los antígenos NA1 y NA2: NA1 Sentido 5’ CTC AAT GGT ACA GGG TGC TC 3’, NA1 Antisentido 5’ GGC CTG GCT TGA GAT GAG GT 3’, NA2 Sentido 5’ CTC AAT GGT ACG GCG TGC TT 3’ y NA2 An- tisentido 5’ CAC CTG TAC TCT CCA CTG TCG TT 3’.
La reacción de PCR fue realizada empleando 250 ng de ADN genómico, Tris HCl (pH 8.3) 20 mM, KCl 50 mM, MgCl2 50 mM, DTT 2 mM, dNTPs 0.2
mM, Taq polimerasa (One Lambda, USA) 1U, 20 pmol de cada primer y H2O libre de nucleasas csp 50 μl. Se realizó la PCR en un termociclador PX2 (Ther- mo electron coorporation, USA) llevándose a cabo en 30 ciclos consistentes
en: 94°C 1 min, 63°C 1 min y 72°C 1 min. Una extensión final a 72°C por 10 min. El material amplificado fue identificado mediante electroforesis en gel de agarosa al 2.5% a voltaje constante (3 V/cm) en tampón TBE 1X y revela- do con Sybr Green 1/1000 (SIGMA-Aldrich, USA). La presencia del alelo NA1 generó fragmentos de 118 pb, y el alelo NA2 generó fragmentos de 171 pb (Hong y col., 2005). Los productos obtenidos fueron observados en transilu- minador a una longitud de onda de 254 nm.
Los alelos NA1 y NA2 son codominantes y pueden presentarse de tres ma- neras: homocigotos para el alelo NA1 (NA1/NA1), heterocigotos para ambos alelos (NA1/NA2) u homocigotos para el alelo NA2 (NA2/NA2). Para determi- nar la frecuencia de los polimorfismos en los pacientes con LES y controles, se utilizó el paquete estadístico SPSS Statistics 20.0 (versión de prueba), se em- pleó el test de X2 en tablas de contingencia 2x3 y 2x2 para las frecuencias ge- notípicas y alélicas respectivamente. El riesgo a la enfermedad se realizo me- diante Odds ratio (OR) para un intervalo de confianza (IC) del 95%.
Fotografía 1. Corrida electroforética del PCR que muestra la escalera de peso molecular en la columna 1, Fragmento amplificado Heterocigoto NA1/NA2 en la columna 2 y Fragmento amplificado homocigoto NA2/NA2 en las columnas 3, 4, 5, 6.
En la tabla 1, al comparar los genotipos FcɣRIIIB entre casos y controles se observa que el genotipo NA1/NA2 es más frecuente en los pacientes lú- picos que en los pacientes no lúpicos, mostrándose además como una fac- tor de riesgo que predispone 4 veces más a un individuo a padecer la enfer- medad (OR 4.29; IC: 2.54 - 6.94). Por otra parte, el genotipo NA1/NA1 es más frecuente en pacientes sin la enfermedad, siendo un genotipo de carácter protector de la enfermedad (OR 0.19; IC: 0.11 - 0.32). Si bien no es estadísti- camente significativo, se observa que el genotipo NA2/NA2 es dos veces más frecuente en los pacientes lúpicos que en los controles. Por otra parte, se ob- serva que desde el punto de vista alélico NA1 es mucho más frecuente en la población de controles sanos (OR 0.39; IC: 0.27-0.56) y el alelo NA2 represen- ta riesgo de padecer LES (OR 2.55; IC: 1,78-3.67),
Tabla 1. Comparación de las frecuencias genotípicas (I/I, I/D, D/D) a alélicas (I, D) del gen FcɣRIIIB expresados por pacientes con LES frente a controles aparentemente sanos.
Polimorfismo genotípico y alélico FcɣRIIIB | Pacientes | Controles | Odds ratio (IC)* | Chi-cuadrado X² (P = α 0.5) | ||
N=134 | % | N=150 | % | |||
NA1/NA1 | 27 | 20.15 | 86 | 57.33 | 0,19 (0.11 – 0.32) | 40.85 (p<0.001) |
NA1/NA2 | 98 | 73.13 | 59 | 39.33 | 4,29 (2.54 – 6.94) | 32.71 (p<0.001) |
NA2/NA2 | 9 | 6.72 | 5 | 3.33 | 2,09 (0.68 – 6.39) | 1.73 (NS) |
Alelo NA1 | 152 | 56.72 | 231 | 77.00 | 0,39 (0.27 – 0.56) | 26.52 (p<0.001) |
Alelo NA2 | 116 | 43.28 | 69 | 23.00 | 2,55 (1.78 – 3.67) | |
I= Inserción, D= Deleción; IC= intervalo de confianza, NS= Probabilidad no significativa
Tabla 2. Asociación del polimorfismo del gen FcɣRIIIB con la susceptibilidad a nefropatía lúpica.
Polimorfismo genotípico y alélico FcɣRIIIB | Con NL | Sin NL | OR(IC)* | Chi-cuadrado X² (P = α 0.5) | ||
N=46 | % | N=88 | % | |||
NA1/NA1 | 14 | 30.43 | 13 | 14.77 | 2.52 (1.07 – 5.97) | 4.61 (p= 0.03) |
NA1/NA2 | 30 | 65.22 | 68 | 77.27 | 0.55 (0.25 – 1.21) | 2.23 (p= 0.13) |
NA2/NA2 | 2 | 4.35 | 7 | 7.95 | 0.53 (0.10 – 2.64) | 0.63 (p= 0.43) |
Alelo NA1 | 58 | 63.04 | 94 | 53.41 | 1.49 (0.89 – 2.49) | 2.28 (p= 0.13) |
Alelo NA2 | 34 | 36.96 | 82 | 46.59 | 0.67 (0.40 – 1.13) | |
I= Inserción; D= Deleción; IC= intervalo de confianza.
La inflamación causada por el depósito de complejos inmunes (comple- jo: anticuerpo-ADN-complemento) en los tejidos es el mecanismo más im- portante en el daño a diversos órganos que se produce en el LES (Lovgren y col. 2004; Davies y col. 2002). La internalización de los complejos inmunes y su posterior destrucción a cargo de las células fagocíticas está mediada por FcɣR (Mannik y Wener, 1997; Salmon y col. 1996). El hecho que exista una me- nor capacidad de fagocitar y depurar CI se debe a polimorfismos de los FcɣR, que se traduce en una menor afinidad del receptor por el complejo inmune, lo cual contribuye al mantenimiento de estos agregados moleculares en cir- culación, favoreciendo su depósito a nivel de diferentes órganos como el ri- ñón, induciendo un proceso inflamatorio, daño tisular y reacciones autoin- munes (Koene y col. 1998).
Salmon y col. (1989) entre otros demostraron que existe una diferencia cuantitativa en la capacidad fagocítica de neutrófilos, la cual está directamen- te influenciada por el polimorfismo de los receptores FcɣRIIIB. Los alelos NA1 y NA2 del FcɣRIIIB tienen implicaciones importantes en las funciones fisioló- gicas de los neutrófilos, especialmente en la capacidad de fagocitar. Los neu- trófilos de individuos homocigotos NA2/NA2 y NA1/NA2 tienen una capaci- dad inferior para fagocitar complejos inmunes que contengan IgG1 y IgG3 que su homólogo homocigoto NA1/NA1 (van der Heijden y col. 2014).
La tabla 1 compara los genotipos de los FcɣRIIIB entre casos y contro- les, observándose que el genotipo Na1/Na2 es más frecuente en el lúpicos y su presencia implica cuatro veces más riesgo de padecer la enfermedad. Xu y col. en 2007 demostró que los pacientes chinos heterocigotos NA1/NA2 son por lo general lúpicos y que este genotipo es poco frecuente en indivi- duos sin la enfermedad. Siriboonrit y col. el 2003 demostró que el genotipo FcɣRIIIB-NA2/NA2 se asoció de forma significativa con la susceptibilidad a la LES en población tailandesa. El genotipo Na1/Na1 se presentó con mayor fre- cuencia en el grupo control, su presencia se asocia como factor protector a la enfermedad. En un estudio similar Gonzales-Escribano y col. (2002) demos- tró la existencia de asociación el genotipo NA2/NA2 con LES. De igual mane- ra, Hatta y col. (1999) estableció que el alelo NA2 es el que se encuentra fre-
cuentemente en pacientes lúpicos (P=0.008). En el presente estudio hemos determinado de manera significativa del el alelo NA2 es un factor de riesgo a lupus (OR= 2,6, p<0,001).
Gonzales-Escribano y col. (2002) afirma que es probable que los fenóme- nos de degranulación extracelulares se incrementen en los individuos NA2/ NA2, permitiendo la liberación de antígenos propios por daño en el tejido y favoreciendo las respuestas autoinmunes. Este aspecto podría ser una de las bases de la asociación entre los polimorfismos FcɣRIIIB-NA1/NA2 y suscepti- bilidad a la LES (González-Escribano, 2002).
La NL es la causa de morbi-mortalidad más frecuente en el LES, en el pre- sente estudio se ha evidenciado que los pacientes lúpicos que padecen NL expresan con mayor frecuencia el genotipo NA1/NA1. En un estudio con 230 pacientes lúpicos y 154 controles Dijstelbloem y col. (2000) evidencia que el genotipo NA1/NA1 esta asociación a NL. Contrariamente, Hatta et al (1999) estableció que los pacientes lúpicos japoneses con NL se caracterizan por portar el genotipo NA2/NA2. Sin embargo, dos meta-análisis realizados en 2009 y 2011 mencionan que no existe asociación entre los polimorfismos ge- néticos del con la susceptibilidad a NL (Lee y col. 2009; Yuan y col. 2011). Los estudios con los que comparamos nuestros resultados no hacen referencia a población latina, dada la heterogeneidad racial entre otros validad la impor- tancia de los estudios de inmunogenética para la búsqueda de polimorfismos de genes candidatos de riesgo a diferentes patologías, en este caso particular lupus y nefropatía lúpica.
En conclusión el presente estudio ha determinado que los individuos que portan el genotipo NA1/NA2 o que portan el alelo NA2 tienen más probabi- lidad de desarrollar LES y cuando el paciente lúpico porta el genotipo NA1/ NA1 tienen mayor probabilidad de desencadenar nefropatía lúpica.
Este estudio fue financiado con recursos concursables IDH de la Univer- sidad Mayor de San Andrés en la gestión 2011-2012. A Torrelli por el aporte brindado que se inicie el inicio del presente trabajo. A la Asociación Bolivia- na de Lucha contra el Lupus (ASBOLUP) por facilitar el acceso a los pacientes.
