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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL.6: 107-124. JUNIO 2018. ISSN: 2310-0265

Diseño y evaluación de primers in silico del gen E1 del virus de chikungunya para Real-Time PCR (qPCR)

Design and Evaluation of primers in silico of the E1 gene of chukungunya virus for Real -Time PCR (q PCR)

DE LA FUENTE, ARIEL1

ROMERO CALLE, DANITZA XIOMARA1 CÁRDENAS ALEGRÍA, OSCAR1 ÁLVAREZ ALIAGA, MARÍA TERESA1

FECHA DE RECEPCIÓN: 13 DE MARZO DE 2018 FECHA DE ACEPTACIÓN: 9 DE MAYO DE 2018

Resumen

El diseño de primers es una parte sustan- cial dentro de los ensayos de PCR, el mismo es aplicado en la caracterización de microor- ganismos, secuenciación, cuantificación, etc. En los últimos años se ha incrementado herra- mientas para este fin, se realizaron nuevas va- riantes, crearon nuevos enfoques, muchas de estas herramientas son de licencia comercial y otros de acceso libre y código abierto per- miten al usuario mejorar o modificar según requerimiento el diseño de primers. En este trabajo comparamos las características bási- cas dentro del diseño de primers, empleando 2 tipos de herramientas web de acceso libre y código abierto: Primer-BLAST y Primer3Plus, se realizó el diseño in silico, análisis de estruc- turas secundarias y verificación de la especifi- cidad de los primers obtenidos. Los resultados mostraron que el uso de variables adicionales o uso de penaltis mediante el software Primer- 3Plus afectan en la especificidad, formación de

Abstract

Primer design is a substantial part of PCR assays, which is used in characteriza- tion of microorganisms, sequencing, quanti- fication, etc. In recent years, new tools have been added for this purpose, new variants and approaches have been created, many of these tools are commercial and others are free including open source, giving the pos- sibility to improve or modify as required. In this work, we compared the basic charac- teristics of the primers design, using 2 types of free and open source web tools, Primer- BLAST and Primer3Plus, in this sense the in silico design, analysis of secondary struc- tures and verification of primers designed. The results showed that the use of addi- tional variables or use of penalties using the software Primer3Plus affect in specificity, secondary structures formation in primers and in the products of amplification. In ad- dition, default parameters, that many soft-

1. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas (IIFB), Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, UMSA.

   
   

   estructuras secundarias de los primers y de los amplicones. Además, se determinó que los pa- rámetros que tienen muchos software por de- fecto, no aseveran el diseño de primers con- venientes y/o específicos, en este sentido es importante realizar el uso de penaltis. Asimis- mo, se identificó que el uso de Primer3Plus ha permitido disminuir la formación de estruc- turas secundarias, sin afectar la especificidad de amplificación del marcador seleccionado.

   ware have, do not imply that suitable and / or specific primers can be obtained, mean- ing the importance of the use of penalties. Therefore, the use of Primer3Plus has al- lowed to decrease the formation of second- ary structures without affecting the ampli- fication specificity of the selected marker.

   
   

   PALABRAS CLAVE

   Diseño de primers, estructuras secundarias, qPCR y software.

   KEY WORDS

   Design of primers, secondary structures, qPCR and software.

   INTRODUCCIÓN

   

   La tecnología genómica moderna permite estudiar millones de regiones de cada muestra de ADN. La mayoría de estas tecnologías requiere la amplifi- cación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), técnica que requiere el uso de primers específicos los mismos no deben formar estructuras secun- darias que afecten el rendimiento de la PCR.

   
   

   El amplio uso de primers universales o publicados en artículos de inves- tigación de referencia son generalmente el resultado del diseño primers, el cual requiere experiencia y destreza por estar sujeto a posibles errores (Ca- milo et al., 2016), en ausencia de primers de referencia es imprescindible el diseño de los mismos. En este sentido, existe una demanda reciente de méto- dos o algoritmos para su diseño, debido también a la proliferación de nuevas tecnologías dentro la genómica y otros campos relacionados (Kim, Kang, An, Koo, & Kim, 2016), además se ha reportado que estos métodos presentan re- sultados favorables (Chuang, Cheng, & Yang, 2013) en los diferentes ensayos e investigaciones incluyendo aplicaciones clínicas (Thierry, y otros, 2014) para la identificación de diferentes microorganismos emergentes. No obstante, va- rios de estos primers han sido diseñados para marcadores específicos o par- ticulares, por lo tanto, la amplificación de estos marcadores no podría ser las mismas o semejantes, afectando de esta forma el éxito del PCR.

   
   

   Aunque no todos los aspectos del proceso de la qPCR están completa- mente descritos y modelados, se conocen ciertos factores que afectan la tasa de éxito de la qPCR, en sistemas que usan el SYBER1 como intercalan- te Green, la detección es más simple y económica de qPCR pero la unión del primer a regiones repetidas de la secuencia de DNA puede ser errónea y ge- nerar productos inespecíficos, otro factor determinante es la temperatura de fusión (Tm) (Pachón, 2017). Los falsos positivos resultan en la formación de primers dimers y amplificación no especifica. El éxito de la PCR depende de la calidad del templado, Taq polimerasa, solución buffer y el diseño de pri- mers en los cuales debe haber un balance entre especificidad y eficiencia.

   
   

   El desarrollo informático ha permitido la creación de diversos softwares que facilitan el diseño de primers incrementando la tasa de éxito del qPCR. Los cuales permiten tanto diseño automático como diseño particular o espe- cifico, de tal forma que nuevos usuarios puedan realizar el diseño manual, y un usuario con experiencia puede realizar un diseño más avanzado (Wang et al., 2016; Lee et al., 2015; Yang et al., 2015), en el que se emplea el uso de pa- rámetros adicionales que son un conjunto de variables que intervienen en su características (Presti et al., 2014).

   
   

   Existen una variedad de software para el diseño de primers muchos de ac- ceso libre como PrimerBlast y Primer3Plus empleado. Los autores del diseño y la creación digital de Primer3Plus, han examinado las versiones más recien- tes de navegadores tales como Firefox, Internet Explorer, Safari and Konque- ror, permitiendo su uso en cualquier navegador. Por otro lado, Primer3Plus funciona con JavaScript, Microsoft Windows y en cualquier sistema operati- vo basado en Unix/Linux.

   
   

   Cuando se diseñan y analizan primers se deben tomar en cuenta princi- palmente 3 aspectos descritos por Thornton & Basu: 1) Los dímeros y horqui- llas de los primers que se produzcan no deberán tener un ΔG muy negativo (< -3.5 kcal/mol), 2) No debe existir horquillas en el extremo 3’, y 3) Las es- tructuras secundarias que resulten, no deben tener un Tm mayor a la tempe- ratura de alineamiento.

   
   

   El diseño de primers está siendo extensamente implementado en mu- chos laboratorios, sean clínicos o de investigación, permitiendo reducir cos- tos, también permite tener un control personalizado y más completo sobre el experimento de la PCR.

   
   

   El presente estudio tiene por finalidad diseñar primers para el gen E1 del virus Chikungunya mediante 2 tipos de software, ambos de acceso libre, Pri- merBlast y Primer3Plus para qPCR. La identificación de este gen (E1 codifica una proteína de membrana conocida por incrementar su habilidad de infec- ción posterior a su mutación) podría ser útil para emplearlo como marcador genético si inicialmente se realiza una retrotranscripción puesto que el virus de tipo RNA de cadena sencilla.

   
   

   MATERIALES Y MÉTODOS

   

   El diseño de primers inicialmente se seleccionó el marcador o región ge- nética del blanco, en gen E1 del virus de Chikunguya (Rodríguez et al., 2015), se utilizó dos programas diferentes para diseño de oligonucleótidos denomi- nados PrimerBlast y Primer3Plus y posteriormente se realizó el análisis de los oligos diseñados con el programa Beacon Designer Free Edition y del ampli- cón resultante mediante UNAFold, figura1.

   
   

   Figura 1. Flujo de trabajo. El diagrama resume la metodología realizada para el diseño In silico de primers.

   
   

   

   
   

   Búsqueda del marcador genético

   La secuencia nucleotídica (563 bp) del gen E1 del virus Chikungunya (CHKV) (Evia, 2015) fue obtenida mediante una búsqueda en la base de datos GenBank, número de acceso JX142137.1. (Benson et al., 2000) para el diseño de los primers orientados al ensayo de PCR cuantitativo (qPCR) mediante pa- rámetros estándar descritos por Rodríguez et al. (2015).

   
   

   Diseño de primers para el gen E1 del virus CHKV

   Se ha diseñado primers que amplifiquen la región del gen E1 del virus CHKV mediante dos sitios web que proporcionan software online: 1) Primer- BLAST (Ye et al., 2012) y 2) Primer3Plus (Untergasser, et al., 2007).

   
   

   1. El diseño de primers en el software Primer-BLAST del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_ LOC=BlastHome) fue realizado de acuerdo a Rodríguez et al. (2015) y Untergasser et al. (2015), para el resto de los parámetros se utilizó los valores predeterminados por el software, figura2 y tabla 1 (Rodriguez et al., 2015; Untergasser, et al., 2007).

      
      

      Tabla 1. Parámetros generales empleados para el diseño de primers en Primer-BLAST

      PARÁMETRO	VALOR	DESCRIPCIÓN
      Secuencia	JX142137.1	Nombre de la secuencia
      Sequence ID	Chikungunya virus CHIKV/IRL/2009 E1 gene	Código de la secuencia
      Product Size Ranges	80-150 100-200	Rangos de tamaño para los amplicones
      Primer Size	20 25 28	Longitudes mínimas, optimas y máximas para los primers diseñados
      Primer Tm	60 64 70	Tm mínimo, optimo y máximo para los primers diseñados
      Max Tm Difference	2	Diferencia máxima aceptable entre los Tm de los primers
      Product Tm	50	Tm mínimo, optimo y máximo para el amplicón
      Primer GC%	35 65 80	Porcentajes mínimos, óptimos y máximos de G y C en cualquier primer
      GC Clamp	0	Numero especifico de Gs y Cs consecutivos en el extremo 3’ de ambos primers
      Concentration of divalent cations	3.5	Concentración milimolar de cationes divalentes
      Concentration of dNTPs	0.20	Concentración milimolar de trifosfatos deoxiribonucleotidos
      Penaltis para los primers (for Primers)
      Tm	Lt=0 - 4 Gt=0 - 4	Describen los penaltis que permiten modificar el criterio que usa Primer3 para seleccionar los mejores primers
      Size	Lt=0 y1 Gt=0 y1
      Self-Complementarity	0 y 3
      3' Self Complementarity	0 y 3
      Penaltis para el par de primers (for Primer Pairs)
      Product tm	Lt=0 y1 Gt=0 y1	Describen los penaltis que permiten modificar y ajustar el criterio que usa Primer3 para seleccionar los mejores primers
      Tm Difference	0 y 2
      Any Complementarity	0 y 3
      3' Self Complementarity	0 y 3

      
      

      Figura 2. Interface básica de Primer-BLAST del NCBI. El programa muestra de forma predeterminada a Homo sapiens como organismo de referencia y no cuenta con organismos o especies de virus

      
      

      

   2. Primer3Plus (Bioinformatics, http://www.bioinformatics.nl/cgi- bin/primer3plus/primer3plus.cgi) fue empleado para el diseño de primers(figura 3), inicialmente la secuencia del gen E1 en formato FAS- TA fue ingresada en Principal (Main), posteriormente se asignaron va- lores fisicoquímicos óptimos para el diseño de primers (tabla 1) en la sección de configuraciones avanzadas (Advanced Settings), consecuti- vamente los penaltis (Penalty weights) fueron ajustados en un rango de 0 a 4 en mediante la variación de la temperatura de fusión (Tm) uno de los parámetros más influyentes para la obtención de primers específi- cos (Untergasser et al., 2007; Rodríguez et al., 2015), de acuerdo a estas modificaciones se obtuvieron 6 grupos de primers (A, B, C, D, E, y F), en el grupo A se asignó el valor de 0 a todos los parámetros en la sección de Penaltis y para el resto de los grupos se asignó los valores de penal- tis predeterminados por el software, el resto de los parámetros fueron estándar (Thornton & Basu, 2011).

Figura 3. Interface de Primer3Plus, 6 secciones dispuestas en pestanas, ordenadas de mayor a menor frecuencia de uso y complejidad.

Análisis In silico de los primers y productos de amplificación

La calidad y especificidad de los primers obtenidos fueron analizados em- pleando Beacon Designer Free Edition (PRIMER Biosoft, http://www.pre- mierbiosoft.com/qOligo/Oligo.jsp?PID=1), se ingresó el par de primers den- tro su interface, seleccionando la opción SYBR®Green y dejando el resto de los campos de forma predeterminada (Figura 4). Asimismo, se identificó la formación de posibles estructuras secundarias (Apte, 2007).

Por otro lado, se analizaron los amplicones resultantes mediante el soft- ware UNAFold (IDT, Integrated DNA Technologies, Inc., https://www.idtdna. com/UNAFold), se ingresó la secuencia del amplicon resultante y asigno el valor de 60 ºC a la temperatura y realizó click en Submit, consecutivamen- te las variables termodinámicas de los amplicones y la formación de dímeros fueron evaluados.

Finalmente, se determinó la especificidad de los primers de acuerdo a los valores de identidad (Ident) y E-Value presentados en Nucleotide-BLAST (Na- tional Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medi- cine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 USA https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch).

Figura 4. Interface de Beacon Desinger Free Edition. La página presenta un formulario de entrada para dos tipos de análisis, TaqMan y SYBRGreen, además, condiciones de la reacción qPCR.

2 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Diseño de primers mediante el Software Primer-BLAST

Inicialmente, se utilizó la secuencia obtenida con número de acce- so JX142137.1 (Figura 5), se ingresó esta secuencia en la interfaz de Primer- BLAST (Figura 2).

Figura 5. Secuencia obtenida de la base de datos de GenBank en formato FASTA con número de acceso JX142137.1, la secuencia tiene 563 bp.

El tiempo de procesamiento del programa para la búsqueda de los pri- mers fue aproximadamente 72 segundos, al terminar el programa reporto una lista de los primers encontrados (Figura 6), en esta lista el primer par de pri- mers obtenidos se muestran en la tabla 2.

Figura 6. Vista de la página de resultados de Primer-BLAST. Se tiene una vista grafica de la ubicación del alineamiento de los primers y un reporte con información detallada de estos.

Tabla 1. Lista de primes diseñados con PrimerBlast, la lista solo contiene el primer par de primers diseñados, posteriores diseños no fueron necesarios en este caso.

Posteriormente, el par de primers obtenidos fueron analizados de forma

In silico con los programas correspondientes.

Análisis de los primers diseñados en PrimerBLAST

Inicialmente, se analizó el par de primers con Beacon Designer Free Edi- tion, diseñado para la evaluación de oligos por sus propiedades termodiná- micas y estructuras secundarias. Posteriormente, se analizó la secuencia am- plificada con UNAFold, que permite predecir los plegamientos o hibridación de ácidos nucleicos (Markham & Zuker, 2008).

Los valores fisicoquímicos, los dímeros y horquillas que podrían formar los primers en el experimento de PCR fueron determinados mediante el soft- ware Beacon Designer (Figura 7).

Figura 7. Resultados del análisis de los primers presentados por Beacon Designer estructuras secundarias entre los primers, junto con la energía libre de Gibbs estimada necesaria para romper los enlaces formados. Los primers qPCR para este estudio mostrados anteriormente contienen dímeros cruzados con una ∆G de -2.4 kcal/mol, dimeros entre los mismos tipos de primers con una ∆G de -5.2 kcal/mol y -1.5 kcal/mol, horquillas con una ∆G de -1 kcal/mol, y una pinza GC.

De acuerdo a las condiciones de reacción estándar, los resultados obteni- dos presentan un vínculo de color rojo que al activarlos se observa la sección donde se encuentran las estructuras secundarias identificadas, agrupadas se- gún el tipo de estructura secundaria, Cross Dimer son las formaciones en- tre Forward y Reverse, Self Dimer son las formaciones entre dos primers del mismo tipo. Para este experimento en la Figura 7 se observan los resultados con ΔG negativos, lo que implica la formación de varios dímeros y horquillas.

1. Para el primer forward (Sense primer) el valor de ΔG fue de -5,2 kcal/ mol en categorizado un valor bajo de acuerdo a los valores de ΔG re- portados por Thornton &Basu, 2011, los mismos no deben ser meno- res a -3,5 kcal/mol. Por lo tanto, existe la probabilidad que se formen estructuras secundarias de tipo ‘Self Dimer’, la energía necesaria para romper los enlaces de estos dímeros tendrá que ser mayor. Sin embar- go, se debe observar si los dímeros tienen interacciones en los extre- mos 3'.

   
   

2. Para el primer reverse (Anti-sense primer) la posible formación del ‘Self Dimer’ presento un ΔG de -1,5 kcal/mol.’.

Asimismo, se observó la presencia de una horquilla (ΔG bajo -1 kcal/mol) y un dímero en el primer Forward con interacción en el extremo 3’ (Lorenz, 2012). Asimismo, en el parámetro ‘Cross Dimer’ se observó valores inferiores a -1 kcal/mol lo cual indica la formación dímeros con interacciones en el ex- tremo 3’ con (Thornton & Basu, 2011).

Análisis del producto de amplificación del gen E1 obtenido mediante Primer-BLAST

El amplicon obtenido de 80 bp fue analizado mediante el software UNA- Fold, se identificó una estructura secundaria (Figura 4). Asimismo, se determi-

nó que la temperatura fusión era superior a la temperatura de alineamiento, por tanto, la formación de estructuras secundarias podría interferir en el de- sarrollo de la qPCR.

Por lo tanto, el Grupo de primers diseñados mediante Primer-BLAST para amplificar el gen E1 del virus CHKV deben ser descartados, y se deben eva- luar otros primers.

Figura 8. Vista de la página de UNAFold, se observan los resultados del análisis (Amplicon gen E1 CHKV) en una lista, según el número de

estructuras secundarias, con sus valores fisicoquímicos. Se observa de forma gráfica en una ventana flotante la estructura secundaria.

Diseño de los primers con Primer3Plus

Se obtuvo 6 grupos de primers: A, B, C, D, E y F de acuerdo a la variación de penaltis, los grupos C y D no formaron estructuras secundarias (ΔG nega- tivas) de acuerdo a el software Beacon Designer, el primer reverse del Grupo B (Tabla 3), el ΔG se encuentra dentro de los rangos de referencia (Thornton & Basu, 2011). Adicionalmente, se observa que los otros grupos si bien presen- tan una temperatura dentro del rango establecido, forman estructuras secun- darias. La temperatura de fusión no debe superar los 60 ºC (Tm) (Thornton & Basu, 2011), ya que podría existir la formación de estructuras secundarias.

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Tabla 2. Lista de los pares de primers obtenidos de acuerdo a los penaltis. Se muestran las características fisicoquímicas de cada secuencia y el ∆G para cada tipo de estructura secundaria, además del número

De la Fuente, A. y col.

de estructuras secundarias formadas. Grupo A sin uso de penaltis.

Se observaron estructuras secundarias en los grupos de primers A, B, E y F, no obstante, los grupos A y B están dentro de los rangos aceptables (> -3.5 kcal/mol y las interacciones entre las bases están distantes al extremo 3’). Sin embargo, los grupos E y F deben descartarse porque presentan ΔG muy ne- gativas y muestran interacciones en más de 2 pares de bases, estas interaccio- nes pondrían afectar el rendimiento de la PCR.

Tabla 3. Estructuras secundarias de los Grupos de primers obtenidas con Beacon Designer Free Edition. Las estructuras formadas deben ser examinadas para determinar si será posible la extensión, evitando

la interacción de más de 2 bp en el extremo 3’, que tengan un ∆G menor a -3.5 kcal/mol.

Se determinó que al asignar valores 1 y 2 como penaltis, los primers dise- ñados son de mayor estabilidad, y al analizarlos en Beacon Designer no for- maron estructuras secundarias, lo que implica que la PCR que se realice con estos primers tendría mejores resultados. Por otro lado, al asignar valores de penaltis mayores a 2, se observa la formación de estructuras secundarias.

Análisis de los amplicones obtenidos en Primer3Plus.

Los amplicones por cada Grupo de primers diseñados en Primer3Plus fue- ron analizados en UNAFold. En la Figura 5, los primers del Grupo C y D pre- sentaban un ΔG positivo o nulo, no obstante los valores de Tm están dentro de los valores de referencia, por tanto se determinó que los mismos son ade- cuados para realizar un ensayo de qPCR en el cual la reacción no excede la temperatura de alineamiento de 60ºC, por tanto, esta reacción es efectiva.

Figura 5. Resultados del análisis en UNAFold de amplicones resultantes.

1. Gen E1 P3P A, amplicon de los primers con penaltis de 0 (Grupo A).

   

   A

   

   B

   

   C

2. Gen E1 P3P B, amplicon de los primers sin formación de estructuras secundarias. C. Gen E1 P3P Grupos C y D),

Con respecto a los resultados obtenidos, se observó que el uso de penal- tis en el software Primers3plus permitió una búsqueda más adecuada de pri- mers, que poseen un equilibrio entre especificidad y eficiencia para un mejor rendimiento en el ensayo de PCR en tiempo real. A diferencia del diseño de primers mediante el uso del software Primers3 en el cual se observó la forma- ción de estructuras secundarias.

Para diseñar primers se debe tener en cuenta no solo los tiempos de aná- lisis, sino el tiempo de búsqueda que dependerá principalmente de la lon- gitud de la secuencia. En este sentido, diferentes software tienen en sus pa- rámetros o variables, valores predeterminados automatizados y avanzados, dirigidos específicamente al diseño de primers de acuerdo a los tipos de PCR.

Especificidad de los primers diseñados

La especificad de los primers fueron evaluados mediante el sitio web de Nucleotide-BLAST, los resultados obtenidos se observan en la Tabla 5, todos los primers presentaron un porcentaje de cobertura de 100%, lo cual indica alta similitud de la secuencia con el gen E1 de virus de la Chikungunya.

Se determinó que el E-valor más cercano a la nulidad corresponde al gru- po B con 0.002, seguido del grupo A con 0.024, pero este grupo no coincide con el target que se busca; y por último los grupos C, D, E y F coinciden con el target que se busca, esta medida es más significativa cuanto más cerca de

0.0 esté, (Sánchez, 2012), la cual es la medida más significativa para evaluar la especificidad de primers en el portal Blast del NCBI.

Por lo tanto, todos los grupos, excepto el grupo A, han tenido resultados significativos para el target de búsqueda, óptimos para su uso en la identifica- ción del virus de la Chikungunya mediante PCR en tiempo real.

Tabla 5. Análisis BLAST de los grupos de primes diseñados mediante software Primer3Plus.

CONCLUSIONES

Existen varias guías para el diseño de primers, en este trabajo se han dise- ñado primers In silico empleando dos tipos de software libres, Primer-BLAST y Primer3Plus, para amplificar la región del gen E1 del virus de la Chikungun- ya empleando los mismos parámetros de entrada para ambos softwares y se determinó la factibilidad, eficacia que presenta el uso de penaltis y la eficien- cia de Primer3Plus que permitió ajustar los parámetros establecidos y el ajus- te de penaltis a un solo parámetro (Tm), para obtener primers más específi- cos sin alterar los parámetros requeridos para llevar a cabo el ensayo de PCR. Los primers obtenidos mediante Primer3Plus son más estables y específicos. Por lo tanto, emplear el uso de penaltis a los diferentes parámetros permitiría mejorar la calidad de los primers y por ende efectivizar un ensayo de qPCR.

AGRADECMIENTOS

Este trabajo ha sido realizado gracias al apoyo académico del Dr. Oscar Cárdenas.

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