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REVISTA CON-CIENCIA N°2/VOL.7: 29-38. NOVIEMBRE 2019. ISSN: 2310-0265
Aplicación del método bioquímico-colorimétrico para identificar agentes trypanocidas
Application of the biochemical-colorimetric method to identify trypanocidal agents
FECHA DE RECEPCIÓN: 7 AGOSTO DE 2019 FECHA DE ACEPTACIÓN: 13 DE SEPTIEMBRE DE 2019
Abstract
American trypanosomiasis is listed among the unattended infectious disease, is caused by the protozoan parasite Trypano- soma cruzi, and has no treatment in the chronic phase of this deadly disease. One of the challenges is finding effective therapies for this complex disease, given that it does not present any associated symptoms to the parasitism and is unknown among tradition- al doctors. Our Faculty is evaluating tacana traditional medicine as a source of potential antiparasitic agents.
The objective of this work was to identify
Licenciado Docente de la Facultas de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas e-mail: udaepuma@gmail.com
Estudiante de Internado Rotatorio de la Carrera de Química Farmacéutica. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas.
Estudiantes de Primer Año de la Carrera de Bioquímica. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas.
Comunario de Buena Vista, Provincia Abel Iturralde. Médico tradicional
Comunario de San Miguel, Provincia Abel Iturralde. Médico tradicional
Comunarios de San Silvestre, Provincia Abel Iturralde. Médicos tradicionales
Philosophy doctor. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas. e-mail: agimenez@megalink.com
Correo de contacto: jagimenez@megalink.com
trypanocidal natural products using the XTT- PMS colorimetric method. For this, growth curves of T. cruzi epimastigotes were made to determine the optimal time to carry out the tests. The initial work population (3x106 par- asites / mL), the incubation conditions (medi- um LIT, 27ºC, 72 hours) and revealed process (XTT-PMS, 4 hours) were selected. With the optimized protocol, activity evaluations of control drugs, natural controls and 20 crude extracts of medicinal plants of the Amazon were carried out. The activity was based on calculations of mean inhibitory concentra- tion and substances with IC50 <50µg/mL were considered active. Of the 20 extracts evalu- ated, 40% were active. The most interesting plants were Sipu sipu (IC50=8.9±1.7μg/mL), Ejije bid'u (IC50=9.1±1.5μg/mL) and Id'ene eidhue (IC50=10.8±1.1μg/mL) with values of IC50 close to the controls, confirming the use- fulness and potential of the developed pro- tocol.
KEY WORDS
Trypanosoma cruzi, Tacana Culture, XTT-PMS Colorimetric Method, Medium Inhibitory Concentration (IC50).
La enfermedad de Chagas, también llamada tripanosomiasis americana, es una enfermedad infecciosa desatendida, potencialmente mortal causada por el parásito protozoo Trypanosoma cruzi. Se encuentra en zonas endémicas de 21 países de América Latina, donde se transmite a los seres humanos prin- cipalmente por las heces de insectos triatomíneos conocidos como vinchu- cas, chinches o con otros nombres, según la zona geográfica (OMS, 2015). En las últimas décadas se ha observado con mayor frecuencia en otros continen- tes debido a la movilidad de la población entre América Latina y el resto del mundo (WHO, 2018). Se calcula que en el mundo hay entre 7 y 8 millones de personas infectadas por Trypanosoma cruzi, de las que el 30% presentan al- teraciones cardiacas y un 10% padecen alteraciones digestivas, neurológicas o combinadas (OPS/OMS, 2010). En nuestro país, se estima que existen unos 607 186 casos de Chagas (Coalición Chagas, 2017).
La fase aguda de la enfermedad de Chagas dura las primeras semanas o meses de la infección y generalmente es asintomática o con algunas manifes- taciones que no son específicas de la enfermedad de Chagas. Durante la fase
crónica la infección puede mantenerse silenciosa por décadas e incluso por toda la vida. Algunas personas infectadas desarrollan complicaciones cardia- cas y otras desarrollan complicaciones intestinales (Apt-B. et al., 2008; CDC, 2017). A causa del gran número de animales silvestres que sirven de reservo- rio a este parásito en las Américas, la enfermedad no puede erradicarse. Los objetivos de control consisten en eliminar la transmisión y lograr que la po- blación infectada tenga acceso temprano a la asistencia sanitaria (WHO, 2018).
El benznidazol (Benz) y el nifurtimox (Nif) son agentes antiparasitarios em- pleados en el tratamiento de la enfermedad de Chagas. El 2017, la Administra- ción de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos (FDA) aprobó al Benz para tratar la enfermedad de Chagas (FDA, 2017). El Nif está en la lista de "Medi- camentos Esenciales" de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para adultos y niños (IntraMed, 2016). Sus efectos adversos (WHO, 1995) deno- tan la necesidad de encontrar agentes antiparasitarios menos tóxicos. La me- dicina tradicional es considerada un interesante punto de partida en la bús- queda de nuevos fármacos, ya que se han encontrado moléculas bioactivas en varias especies vegetales utilizadas en la medicina tradicional. La cultura tacana, ubicada al norte del Departamento de La Paz, cuenta con más de un centenar de especies vegetales que utilizan para el tratamiento de diferentes dolencias, por lo que desde 1993 el IIFB se ha interesado en valorar especies de su medicina tradicional realizando estudios de química biodirigida, con el propósito de encontrar agentes antiparasitarios eficaces.
La evaluación de actividad biológica se realiza por medio de ensayos de proliferación celular. Los Microculture Tetrazolium Assays (MTAs) son bioen- sayos rápidos, sensibles y no radioactivos que permiten medir la viabilidad celular en base a la actividad metabólica de las células vivas (Kulkarni et al., 2003). El MTT produce sales de formazán insolubles, lo cual alarga el procedi- miento al necesitar solventes orgánicos para disolver estas sales. Para resolver esta dificultad se utiliza el XTT, una sal levemente amarilla que cuando se re- duce por las oxidoreductasas mitocondriales se vuelve formazán, una sal so- luble de color naranja brillante (Esquema 1). Esta variación colorimétrica se mide en un lector de absorbancia, con una longitud de onda de 450nm y una longitud de onda de referencia de 630nm. Los resultados mejoran cuando se tiene un aceptor intermedio de electrones, como el PMS (ATCC, 2011; Sala- manca-Capusiri et al., 2008; Williams et al., 2003).
En este trabajo se identificaron extractos de plantas con actividad trypa- nocida utilizando el método colorimétrico XTT-PMS estandarizado.
Cabina de Seguridad Biológica (SECURIPLUS PSM Classe II, Francia); Estu- fa (Standard Incubator, WTB Binder, Alemania); Frascos de Cultivo Tisular de 50mL (25cm2 Fisher Scientific, USA); Lector de Microplacas (BioTek Synergy HT, USA. Software Gen 5. 2.09); Microscopio de Fluorescencia (EVOS FL, Life Technologies, USA); Microscopio Óptico (Leitz, Alemania); Microscopio Óp- tico Invertido (Axiovert 25, Zeiss, Alemania), Placas de 96 Pozos, Fondo Plano (Thermo Scientific, USA).
KCl y NaCl (Biopack, Argentina); NaHCO3 (Cicarelli, Argentina); Infusión de hígado (DIFCO, USA); Gentamicina (VWR, USA); Caldo Triptosa; Dimetil- sulfóxido (DMSO); Extracto de Levadura, Fenasin Metosulfato (PMS); NaH- 2PO4, Na²HPO4, Glutaraldehído; Hemina; Sal Sódica de 2,3-bis-(2-metoxi- 4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida (XTT); Suero Bovino Fetal (SBF) y Trietanolamina (Sigma-Aldrich, USA).
Alcaloides totales de la corteza de Galipea longiflora Krause (CAT, 50- 6.3μg/mL) y 2-fenilquinolina (2FQ, 50-6.3μg/mL, Giménez et al., 2005). Doxo- rubicina Clorhidrato Doxocris ® (1.5–0.2μg/mL, LKM Bolivia S.A, donada por Ricardo Amaru-Unidad de Biología Celular-Facultad Medicina-UMSA). Milte- fosina (3–0.4μg/mL, Impavido®, Paladin, Canadá). Benznidazol (25–3.1μg/mL, Lafepe, Brasil). Nifurtimox (3–0.4μg/mL, Lampit ® Bayer, Alemania). Extractos crudos (100–3.1μg/mL).
Cultivados a 27ºC en medio Liver Infussion Tryptose (LIT, 3mL, 5.0g/L de NaCl, 7.5g/L de Na2HPO4, 5.0g/L de Caldo Triptosa, 3.0g/L de Extracto de Le- vadura, 3.0g/L de Infusión de Hígado, 0.4g/L de KCl, 20.0mg/L de Hemina en 1mL/L de Trietanolamina y 1.0mL/L de agua destilada, 50.0mg/L de Gentami- cina, pH 7.2, 5%v/v de SBF desactivado por calor). El cambio de medio se rea- lizó cada 72hrs.
Las plantas fueron colectadas en base al acuerdo de colaboración sobre saberes ancestrales con el Consejo Indígena de los Pueblos Tacana (CIPTA) y el Consejo Indígena de Mujeres Tacana (CIMTA), por el personal del Área de Química Farmacéutica (AQF-IIFB) alrededor de las comunidades Buena Vista (S 14°21’969’’ y O 67°33’764’’, elevación 205 m.s.n.m), San Silvestre (S 14°04’412’’ y O 67°51’837’’, elevación 222 m.s.n.m) y San Miguel (S 14°30.524’’
y O 67°29.547’, elevación 276 m.s.n.m), provincia Abel Iturralde del departa- mento de La Paz-Bolivia. Las muestras Vaucher fueron depositadas y se en- cuentran en proceso de identificación en el Herbario Nacional de Bolivia (LPB). Los extractos crudos fueron preparados por maceración etanólica por 72hr, a temperatura ambiente, filtrados y llevados a sequedad en rota-evapo- rador y secados al vacío hasta peso constante o por fluido súper crítico con CO2 a 2000psi y 370C, por 10hrs, en el AQF-IIFB.
El XTT (1mg/mL) y PMS (0.05mg/mL) (Henriques et al., 2011) disuelto en PBS (2.86g/L de Na2HPO4, 0.31g/L de NaH2PO4, pH 7.4) y depositado (50μL / pozo). Luego de la incubación como descrito y se realizaron las lecturas de absorbancia a 450 (630nm de referencia).
Epimastigotes de Trypanosoma cruzi (1x106 parásitos/mL) en medio LIT y 5%v/v de SBF. Incubados como descrito, por 5 días. El recuento de población se realizo en cámara de Neubauer y en paralelo mediante la lectura de den- sidad óptica a 450nm (630nm como referencia de absorbancia del medio). El procedimiento se realizó por triplicado y tres repeticiones.
Epimastigotes de Trypanosoma cruzi con poblaciones de 1.2x107, 6x106, 3x106, 1.5x106 y 7.5x105 (ajustadas con medio LIT y 5%v/v de SBF). Fueron in- cubadas por 72hrs a 27ºC. Finalmente, se adiciono el agente revelador (XTT- PMS) y se realizó la lectura de densidad óptica como descrito, cada hora du- rante 7 horas. El procedimiento se realizó por triplicado en tres repeticiones.
En placas de cultivo de 96 pozos se dispensaron 100µL de epimastigo- tes (3x106 parásitos/mL). Posteriormente, a diferentes pozos se agregaron 100µL de las concentraciones preparadas de drogas control, controles natu- rales y extractos crudos, incluyendo pozos “Blanco” (200µL de LIT) y “Control de Crecimiento” (200 µL de epimastigotes). Cada muestra se evaluó por tri- plicado, obteniendo un valor promedio y desviación estándar. Muestras con CI50>50µg/mL fueron consideradas inactivas.
Los valores de densidad óptica (absorbancia) fueron transformados en porcentaje de inhibición (Software Gen 5. 2.09), donde el 100% de inhibición representa la absorbancia del “Blanco”. La conversión del porcentaje de inhi- bición a su correspondiente valor de la CI50 se realizó en el programa Micro- soft Excel, por función de tendencia lineal, donde “y” es porcentaje de inhibi- ción y “x” es la concentración en μg/mL.
El coeficiente de correlación lineal R² de ambas mediciones (conteo en cámara de Neubauer y lectura de absorbancias), permitió reconocer el com- portamiento lineal del crecimiento de los parásitos, por un lapso de 5 días, reflejando que durante este tiempo los parásitos se encuentran en fase loga- rítmica de crecimiento. A las 72 horas de incubación se consiguió duplicar la población inicial, por lo que fue definido como el tiempo de incubación ideal para medir la CI50 (Gráfico 1). El R² de las absorbancias (método colorimétri- co) fue mayor que el de la población contada en cámara de Neubauer (méto- do óptico), lo cual refleja que el método colorimétrico es más sensible a pe- queñas variaciones que el ojo humano.
Trypanosoma cruzi
Las poblaciones de 3x106, 1.5x106 y 7.5x105 mostraron comportamiento li- neal. Sin embargo, la población de 3x106, desde las 4 horas de incubación con XTT-PMS, dio lugar a valores de absorbancia correspondientes casi al doble de las del blanco (Gráfico 2 y Tabla 1), a diferencia de las poblaciones inicia- les de1.5x106 y 7.5x105 cuyas absorbancias no difirieron lo suficiente con re- lación al blanco. La necesidad de tener esta diferencia de absorbancias radica en que durante el desarrollo de las pruebas de evaluación de actividad trypa- nocida necesitamos detectar valores de absorbancia superiores al blanco y correspondientes a la mitad del control positivo de crecimiento, para poder calcular los valores de CI50.
Los resultados de la puesta a punto del método colorimétrico XTT-PMS para Trypanosoma cruzi reflejaron que lo ideal es trabajar dentro de los pri- meros 5 días de crecimiento logarítmico del parásito, exponiendo a las mues- tras por evaluar, una población inicial de 3x106parásitos/mL, seguido de una incubación de 72 horas a 270C y posterior revelado con XTT-PMS, con 4 ho- ras de incubación adicional.
Población | 1.2x107 | 6x106 | 3x106 | 1.5x106 | 7.5x105 | BLANCO | 3x106
Blanco |
Horas | |||||||
1 | 0.478 | 0.458 | 0.405 | 0.343 | 0.302 | 0.306 | 1.322 |
2 | 0.704 | 0.630 | 0.527 | 0.424 | 0.350 | 0.348 | 1.517 |
3 | 0.955 | 0.819 | 0.661 | 0.513 | 0.404 | 0.393 | 1.682 |
4 | 1.143 | 0.967 | 0.772 | 0.588 | 0.450 | 0.436 | 1.772 |
5 | 1.305 | 1.125 | 0.896 | 0.676 | 0.503 | 0.474 | 1.891 |
6 | 1.452 | 1.282 | 1.026 | 0.767 | 0.558 | 0.523 | 1.962 |
7 | 1.558 | 1.411 | 1.133 | 0.842 | 0.608 | 0.566 | 2.000 |
El protocolo adaptado y aplicado nos permite evaluar sustancias puras tanto de origen sintético (las drogas control) como naturales (CAT y 2FQ). El trabajo de Luna et al 2009, determina la IC50 de las drogas control, en M, frente a epimastigotes de diversas cepas de T. cruzi, aisladas en Colombia, el intervalo de valores presentado en la Tabla 2 están ya transformado a g/mL,
para poder comparar los resultados. Moreira et al. 2013, solo reporta datos para el Benznidazole. Los controles naturales CAT y 2FQ, fueron similares a los obtenidos por Arevalo (2018) y es primera vez que se reportan datos para Doxorrubicina frente a T. cruzi.
Controles | Arevalo. | Moreira et al. | Luna et al. | |
Controles | autores | (2018) | (2013) | (2009) |
CAT | 16.6±2.9 | 19.3±3.1 | - | - |
2FQ | 21.2±1.1 | 25.6±5.7 | - | - |
Benznidazole | 7.0±2.6 | 10.5±2.5 | 9.0 | 2.9-11.1 |
Nifurtimox | 1.2±0.3 | 1.8±0.2 | - | 0.4-1.5 |
Miltefosina | 1.2±0.7 | - | - | 0.4-1.6 |
Doxorubicina | 0.9±0.2 | - | - | - |
El presente protocolo ha sido aplicado en la valoración de diversos extrac- tos crudos de plantas medicinales utilizadas por la etnia Tacana, para su cla- sificación como activos o inactivos frente Trypanosoma cruzi (Tabla 3), de- mostrando su utilidad en los laboratorios dedicados a la tarea de encontrar especies con actividad antiparasitaria.
De los 20 extractos crudos obtenidos de las plantas medicinales ta- cana, el 40% (8 extractos) presentaron valores de CI50<50mg/mL y el 60% (12 extractos) fueron catalogados como inactivos. De las ocho plantas ac- tivas, las más interesantes fueron Sipu sipu (CI50=8.9±1.7µg/mL), Ejije bid’u (CI50=9.1±1.5µg/mL) e Id’ene eidhue (CI50=10.8±1.1µg/mL), que presentaron valores de CI50 inferiores a los controles naturales CAT (CI50=16.6±2.9µg/mL) y 2FQ (CI50=21.2±1.19µg/mL) y en particular Sipu sipu y Ejije bid’u con ac- tividad del orden del Benz (CI50=7.0±2.6µg/mL). Las otras 5 plantas activas (Uembe, Cawuara, Bacua etse, Siyaya macho y Berwena) presentaron valores de CI50 semejantes o mayores a los controles, permitiendo inclusive una sub- división de los activos, frente a los controles (Tabla 3).
El método colorimétrico XTT-PMS aplicado, arrojo resultados sobre las drogas control utilizadas, Benznidazole, Miltefosina y Nifurtimox, y a los con- troles naturales de Galipea longiflora, congruentes con otros autores y por lo tanto es aplicable para la evaluación, identificación y selección de productos naturales y extractos crudos de plantas con actividad trypanocida, in vitro, so- bre epimastigotes de Trypanosoma cruzi.
Especies Botánicas | Nombre Tacana | CI50 (μg/mL) | |
Género especie | Activos (CI50≤50µg/mL) | ||
1 | Piper umbellatum | Sipu sipu | 8.9±1.7 |
2 | Capsicum spp | Ejije bid’u | 9.1±1.5 |
3 | Hyptis brevipes | Id’ene eidhue | 10.8±1.1 |
4 | Philodendron undulatum | Uembe | 21.6±2.1 |
5 | Tessaria integrifolia | Cawuara | 23.1±0.5 |
6 | Scoparia dulcis | Bacua etse | 24.1±0.6 |
7 | Chamaedorea angustisecta | Siyaya macho | 54.0±10.2 |
8 | Stachytarpheta cayennensis | Berwena | 56.2±10.3 |
Inactivos (CI50>50µg/mL) | |||
9 | Aphelandra cf. aurantica | Tse buke ina | >50 |
10 | Duguetia spixiana | Budhe ina | >50 |
11 | Macfaidyena unguis-cati | Bechu juno | >50 |
12 | Palicourea lasiantha | Ejije nawarao | >50 |
13 | Picramnia spruceana | Idiria | >50 |
14 | Palicourea punicea | Uchi ina | >50 |
15 | Sida rhombifolia | Judhu ina | >50 |
16 | Jatropha curcas | Waca janidhe | >50 |
17 | Justicia albadenia | Bamare batse piadha | >50 |
18 | Dieffenbachia williamsii | Chura ina | >50 |
19 | Chondrodendron tomentosum | Dharara junu | >50 |
20 | Phyllanthus niruri | Tumba piedra | >50 |
A los proyectos UMSA-ASDI: Bioprospección Tacana y Biomoléculas (anti- parasitarios), por el apoyo financiero (75000553). Al CIPTA y CIMTA por facili- tar los trabajos de campo en las comunidades Tacana. Uno de los co-autores (PTCI) recibió beca del Programa Fortalecimiento UMSA-ASDI, Maestría en Ciencias Biológica y Biomédicas de la UMSA.
OPS/OMS. (2010). Algunos Datos y Cifras: Mundo y las Américas. Recuperado de www.paho.org/par
