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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 7: 21-30. ABRIL 2019. ISSN: 2310-0265
Método fluorométrico para identificar agentes naturales citotóxicos y su aplicación en la evaluación de agentes antiparasitarios selectivos
Fluorometric method for the identification of cytotoxic natural agents and its application in the evaluation of selective antiparasitic agents
FECHA DE RECEPCIÓN: 13 FEBRERO DE 2019 FECHA DE ACEPTACIÓN: 16 DE ABRIL DE 2019
Abstract
The Ministry of Health has infectious diseases as one of the research priorities, including leishmaniasis and American try- panosomiasis. The Faculty of Pharmaceuti- cal and Biochemical Sciences develops eval- uations of medicinal plant species used by the Tacana culture as a source of potential antiparasitic agents.
Laboratories dedicated to the discovery of natural molecules with antiparasitic ac- tivity, have the challenge of developing pro- tocols that allow the detection of selective, effective and less toxic biomolecules than those available. Therefore, in vitro antipar-
Philosophy Doctor. Instituto de Investigaciones Fármaco e-mail: biojuancarlos@yahoo.com
Licenciado en Bioquímica y Farmacia. Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas. e-mail: udaepuma@gmail.com
Estudiante de Internado Rotatorio. Carrera Química Farmacéutica. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas.
Estudiantes de 1er año Carrera de Bioquímica. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas.
Comunarios de San Silvestre, Provincia Abel Iturralde. Médicos tradicionales.
Comunario de San Miguel, Provincia Abel Iturralde. Médico tradicional
Comunarios de Buena Vista, Provincia Abel Iturralde. Médicos tradicionales.
asitic evaluations (IC50) should be accompa- nied by cytotoxicity evaluations (LD50), in or- der to calculate a Selectivity Index (IS = LD50
/ IC50) as a parameter of biological specificity. The cytotoxicity was measured on mac- rophage line (RAW 264.7, murine), cells en-
gaged on intracellular parasites infections. The fluorometric protocol starts with an ini- tial population of 5x104 cells/mL, incubated at 37ºC, in DMEM (Dulbecco's Modified Ea- gle's medium) for 96 hours with addition of resazurin (2mM) 3 hours, before final read- ings. Under these conditions the cytotoxic- ity of control drugs and 15 plant extracts, se- lected by their anti-kinetoplastid activity, was evaluated. Cosumailu extract was the most cytotoxic, Ejije bid’u was selective for
T. cruzi, and Leishmania amazonensis, while Id’ene eidhue, was selective for L. amazo- nensis. Finally, the other 12 extracts were lit- tle selective or cytotoxic.
Trypanosoma cruzi, Leishmania amazonensis, Células RAW 264.7, Cultura Tacana, Método
KEY WORDS
Trypanosoma cruzi, Leishmania amazonensis, RAW 264.7 cells, Tacana culture, Resazurin Fluorometric Method, Selectivity Index.
Las Leishmaniasis, con sus diversas manifestaciones clínicas, causada por dis- tintas cepas de parásitos del género Leishmania spp. y la enfermedad de Cha- gas (tripanosomiasis americana), potencialmente mortal, causada por el parási- to protozoo Trypanosoma cruzi, forman parte de las enfermedades infecciosas desatendidas (OMS, 2015). En nuestro país, las infecciones por parásitos de Leis- hmania ocurren en 7 de los 9 Departamentos (Martinez et al., 2002) y se estima que existen más de medio millón de casos de Chagas (Coalición Chagas, 2017). A causa del gran número de animales silvestres que sirven de reservorio a es- tos parásitos, estas enfermedades son difíciles de erradicar y requieren de un acceso temprano a la asistencia sanitaria para su cura (WHO, 2018).
El benznidazol y el nifurtimox son agentes antiparasitarios empleados en el tratamiento de la enfermedad de Chagas, mientras que el glucantime y la an- fotericina B son utilizados en el tratamiento de las leishmaniasis. Los efectos adversos, de todas estas drogas, denotan la necesidad de encontrar agentes
antiparasitarios menos tóxicos (WHO, 1995). La medicina tradicional es una base interesante en la búsqueda de nuevos tratamientos, ya que las plantas son fuente de moléculas bioactivas, que podrían servir de base para el desa- rrollo de nuevos tratamientos antiparasitarios. La etnia Tacana, ubicada al nor- te del Departamento de La Paz, cuenta con centenares de especies vegetales documentadas que se utilizan para el tratamiento de diferentes dolencias, por lo que el Área de Química Farmacéutica del Instituto de Investigaciones Fár- maco Bioquímicas se ha interesado en valorar su medicina tradicional, con el propósito de buscar agentes antiparasitarios eficaces y selectivos.
Históricamente, el inicio del proceso de descubrimiento de fármacos se concentra en reconocer la efectividad in vitro y/o in vivo de las drogas candi- datas, utilizando como parámetro el valor estimado de la Concentración In- hibitoria Máxima Media (CI50), que indica la cantidad de una sustancia nece- saria para inhibir un proceso biológico a la mitad (Aykul et al., 2016). Al mismo tiempo, la seguridad de las drogas es un criterio clave para el desarrollo de nuevos tratamientos. Las observaciones que se logran obtener en ensayos de eficacia y seguridad, in vitro, se encuentran en los primeros pasos de desarro- llo de un fármaco y sirven para justificar y ahondar en mediciones de seguri- dad y eficiencia en modelos más próximos al desarrollo, de estas complejas enfermedades parasitarias (Muller et al., 2012).
Las células RAW 264.7 son macrófagos murinos transformados con el vi- rus Abelson de leucemia murina (ATCC, 2017) y suelen ser utilizados para es- tudios de citotoxicidad (Habtemariam, 1997) y para evaluar el efecto, de pro- ductos naturales, en la producción de citosinas y mediadores inflamatorios (Kolodziej et al., 2005). La citotoxicidad in vitro se mide por medio de ensayos de proliferación como el método fluorométrico con resazurina, un compues- to azul no tóxico y no fluorescente, que es reducido a un colorante rojo fluo- rescente, llamado resofurina, debido a la transferencia electrónica mediada por enzimas mitocondriales, en todas las células vivas. La detección de esta reacción se realiza empleando un lector de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 530 a 560 nm y una lectura de emisión a 590 nm longi- tud de onda. La reducción de la resazurina se correlaciona con el número de organismos vivos con actividad metabólica. Es un ensayo rápido, confiable, sensible, seguro y económico (Biotium: Glowing Products for Science, 2015; Carneiro-Borra et al., 2009). El contar con datos de dosis letal media frente a células (DL50) y datos de Inhibición media frente a parásitos (IC50), permite calcular el Índice de Selectividad (IS), herramienta matemática utilizada para identificar compuestos que son tóxicos para los parásitos pero no para las cé- lulas huésped, en infecciones intracelulares (leishmaniasis y el mal de Cha- gas), en una etapa temprana del complejo proceso de selección de candida- tos para el descubrimiento de nuevos fármacos (WHO, 2015).
En este trabajo se seleccionaron extractos de plantas medicinales de la cultura tacana que previamente presentaron diversos niveles de actividad biológica (IC50) frente a parásitos de Leishmania amazonensis y Trypanosoma cruzi, para evaluar su citotoxicidad, frente a células RAW 264.7, utilizando el método fluorométrico de la resazurina, con el fin de calcular sus respectivos Índices de Selectividad.
Cabina de Seguridad Biológica (SECURIPLUS PSM Classe II, Francia); Cen- trifuga (Jouan CR3i, Thermo Fisher Scientific, USA); Estufa (Midi 40 CO2 Incuba- tor, Thermo Fisher Scientific, USA); Frascos de Cultivo Tisular de 50mL (25cm2, Fisher Scientific, USA); Lector de Microplacas (BioTek Synergy HT: Multi-Mode Microplate Reader, USA. software Gen 5 versión 2.09); Microscopio de Fluo- rescencia (EVOS FL Cell Imaging System, Life Technologies, USA); Microscopio Óptico (Leitz Aristoplan, Alemania); Microscopio Óptico Invertido (Axiovert 25, Zeiss, Alemania) y Placas de 96 Pozos, Fondo Plano (Thermo Scientific, USA).
Reactivos
Bicarbonato de Sodio (NaHCO3, Cicarelli, Argentina); Gentamicina (VWR, USA). Sigma-Aldrich: Dimetilsulfóxido (DMSO); Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM); Na2HPO4; NaH2PO4; Medio Roswell Park Memorial Institu- te (RPMI, 1640-HEPES); Piruvato de Sodio; Sal Sódica de Resazurina; Penicili- na; Estreptomicina y Suero Bovino Fetal (SFB)
Drogas control y extractos vegetales (concentraciones de evaluación)
Alcaloides totales de la corteza de Galipea longiflora Krause (CAT, 50.0– 6.3μg/mL) y 2-fenilquinolina (2FQ, 100.0–12.6μg/mL) (Giménez et al., 2005); Anfotericina-B (Cipla Ltd, Goa, India, AmB, 50.0–6.2μg/mL); Benznidazol (La- fepe, Brasil, Benz, 400.0–50.0μg/mL); Doxorrubicina Clorhidrato (Doxocris ®, LKM Bolivia S.A, donada por Ricardo Amaru-Unidad de Biología Celular-Fa- cultad Medicina-UMSA, Dox, 1.5–0.2μg/mL); Miltefosina (Impavido®, Paladin, Canadá, 50.0–6.2μg/mL); Nifurtimox (Lampit ® Bayer, Alemania, 50.0–6.2μg/ mL). Extractos de platas medicinales en DMSO (100–0.8μg/mL).
Material biológico
Células RAW 264.7 (Donadas por el Instituto Sahlgrenska, Universidad de Gotemburgo, Suecia) fueron cultivadas en frascos de cultivo (50mL), a 37ºC, 5% de CO2 y 100% de humedad en 3mL de Medio DMEM completo (17.3g/L de DMEM, 110.0mg/L de Piruvato de Sodio, 1.5g/L de NaHCO3, 1%v/v de Penicilina-Estreptomicina, pH 7.4, 10%v/v de SBF desactivado por calor) (ATCC, 2017); Medio DMEM sin piruvato (17.3g/L de DMEM, 1.5g/L de NaH- CO3, 1%v/v de Penicilina-Estreptomicina, pH 7.4, 10%v/v de SBF desactiva- do por calor) y Medio RPMI (60.0mg/L de Gentamicina, 2.13g/L de NaHCO3, 15.89g/L de RPMI 1640-HEPES, pH 7.4, 10%v/v de SBF desactivado por calor). El cambio de medio se realizó cada 72hrs previo desprendimiento mecánico.
Curva de crecimiento
El pellet de células, RAW 264.7, obtenido de la suspensión celular centrifu- gada (2000rpm, 10min), fue resuspendido en el medio de cultivo correspon- diente (2mL): DMEM completo, DMEM sin piruvato y RPMI. Se realizó el re-
cuento en cámara de Neubauer, para ajustar la población a 2x104 células/mL (con los medios correspondientes) y 10%v/v de SBF. Se incubó como indica- do y se realizaron lecturas diarias por 5 días, para el trazo de las curvas. El pro- cedimiento se realizó por triplicado en tres repeticiones y la media se graficó.
Elección de población óptima de trabajo y tiempo de revelado
Poblaciones ajustadas a: 1.25x104; 2.5x104; 5.0x104; 1.0x105 y 2.0x105 célu- las/mL, fueron incubadas por 96hrs a 37ºC, con 5% de CO2 y 100% de hume- dad. Luego de la adición del reactivo revelador (resazurina) se realizó la lec- tura del incremento de población (540nm excitación y 590nm emisión) cada hora durante 5 horas. El procedimiento se realizó por triplicado en tres repe- ticiones y la media se graficó.
Material vegetal y obtención de extractos crudos
Las plantas fueron colectadas por el personal del Área de Química Farma- céutica (AQF-IIFB) alrededor de las comunidades Buena Vista (S 14°21’969’’ y O 67°33’764’’, elevación 205 m.s.n.m), San Silvestre (S 14°04’412’’ y O 67°51’837’’, elevación 222 m.s.n.m) y San Miguel (S 14°30.524’’ y O 67°29.547’, elevación 276 m.s.n.m), provincia Abel Iturralde del departamento de La Paz- Bolivia. Las muestras Voucher fueron depositadas e identificadas en el Her- bario Nacional de Bolivia (LPB). Los extractos crudos fueron preparados por maceración etanólica por 72hr, a temperatura ambiente, filtrados y llevados a sequedad en rota-evaporador y secados al vacío hasta peso constante o por fluido súper crítico con CO2 a 2000psi y 37ºC, por 10hrs, en el AQF-IIFB.
Evaluación de citotoxicidad sobre RAW 264.7
En una placa de cultivo de 96 pozos, los pozos de la periferie fueron llena- dos con 200µL de agua destilada autoclavada. En cada uno de los pozos res- tantes se dispensaron 100µL de células (5x104 celulas/mL). A las 24hrs de in- cubación se añadieron 100µL por pozo de las diferentes concentraciones de drogas control, controles naturales y muestras. Los pozos “Blanco” y el “Control Positivo de Crecimiento” contenían 200µL de medio de cultivo y 200uL de cé- lulas respectivamente. Se incubó como indicado por 72hrs. Cada muestra fue evaluada por triplicado, obteniendo un valor promedio y desviación estándar.
Obtención de DL50
Para el revelado, se empleó resazurina (2mM) disuelta en PBS (2.86g/L de Na2HPO4, 0.31g/L de NaH2PO4, pH 7.4) y depositada en la placa (10μL/pozo). Tras 3hrs de incubación se realizó la lectura de fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 540nm y una longitud de onda de emisión de 590nm en el programa Gen5 (Promega, 2016). Los valores de fluorescencia fueron transformados en porcentaje de inhibición, donde el 100% correspon- día a la absorbancia del “Blanco”. La conversión del porcentaje de inhibición a su correspondiente valor de CI50 se realizó en Microsoft Excel por función de tendencia lineal (y=porcentaje de inhibición; x=concentración en μg/mL).
Obtención de los índices de selectividad (IS)
El IS se obtiene dividiendo la DL50 (RAW 264.7) entre la CI50 (parásito): IS=DL50 / CI50
TIS = DL50 RAW 264.7 / CI50 T. cruzi
LIS = DL50 RAW 264.7 / CI50 L. amazonensis
El medio DMEM completo resultó ser el mejor para el cultivo de células RAW 264.7, ya que su coeficiente de correlación lineal R2 (0.9074) resultó ser el más elevado de los tres medios evaluados (Gráfico Nº1). En este medio de cultivo, la fluorescencia fue aumentando día a día, demostrando la actividad metabólica de las células. El día 4 la población celular se duplicó, lo que in- dica que es el momento ideal para realizar la medida de DL50. El medio RPMI permitió el crecimiento de las células RAW 264.7, pero podría considerarse que la fase de adaptación (lag) dura un día más que con el DMEM completo. Finalmente, el medio DMEM sin piruvato no dio lugar a un crecimiento expo- nencial, a lo largo del experimento.
En condiciones aeróbicas, el piruvato formado en el último paso de la gli- cólisis se oxida a acetil-CoA, por la PDH (piruvato deshidrogenasa) que en el ciclo del ácido cítrico, se oxida a CO2 y H2O y el equilibrio redox se reestable- ce tras la transferencia de electrones del NADH+ al O2 durante la respiración mitocondrial. La acetil-CoA puede modular negativamente la PDH, inhibien-
do el ciclo del ácido cítrico y promoviendo la gluconeogénesis por modula- ción positiva de la piruvato carboxilasa. El piruvato participa en reacciones anapleróticas que reponen intermediarios del ciclo del ácido cítrico (malato y oxalacetato), lo cual sostiene la actividad de este ciclo (Heart et al., 2009). Por estas razones metabólicas es que el piruvato es necesario para el crecimien- to de las células en estudio.
Los valores de coeficiente de correlación lineal demuestran que las pobla- ciones 1x105 y 5x104 tuvieron el comportamiento más lineal en medio DMEM completo (Tabla Nº1 y Gráfico Nº2). Con 5x104 de población se obtuvieron va- lores de fluorescencia equivalentes a más del doble del blanco, a las 3 horas de incubación con resazurina, lo cual se considera suficiente para ser detec- table respecto al blanco. Se recomienda no realizar la lectura más allá de las 3 horas, ya que la fluorescencia del blanco va disminuyendo pasadas las 4 horas.
Horas | Población | ||||||
2x105 | 1x105 | 5x104 | 2.5x104 | 1.25x104 | BLANCO | 5x104 BLANCO | |
1 | 1.553.167 | 1.077.167 | 906.667 | 853.333 | 860.667 | 712.000 | 1.273 |
2 | 5.614.167 | 2.599.667 | 1.361.500 | 1.032.167 | 958.000 | 765.667 | 1.778 |
3 | 9.054.000 | 4.007.167 | 1.953.167 | 1.336.833 | 1.168.833 | 957.667 | 2.039 |
4 | 11.979.833 | 5.320.667 | 2.527.333 | 1.615.667 | 1.339.333 | 1.103.000 | 2.291 |
5 | 14.589.500 | 6.828.667 | 3.134.500 | 1.900.500 | 1.496.333 | 1.055.333 | 2.970 |
Los resultados de la puesta a punto del método fluorométrico de la resazu- rina para RAW 264.7, nos muestran que lo ideal es trabajar dentro de los prime- ros 5 días, tiempo en el cual las células mantienen el crecimiento logarítmico, sembrando una población inicial de 5x104 células (día 0) e incubar por 24 ho- ras antes de añadir las muestras a evaluar (día 1), continuar con la incubación por 72 horas y revelar con resazurina (día 4) incubando por 3 horas adicionales
Un total de 15 extractos de plantas medicinales utilizadas por la etnia Ta- cana fueron seleccionados y sometidos a evaluaciones de citotoxicidad por el método fluorométrico. Entre éstas, 11 presentaron actividad anti-kineto- plastidos (T. cruzi y L. amazonensis), 1 extracto activo sobre T. cruzi, 1 extrac- to con actividad leishmanicida, y 2 extractos sin actividad antiparasitaria (Pro- grama UMSA-ASDI, 2019). De los 15 extractos evaluados, un total de 3 (Ejije bid’u, Id’ene eidhue y Kuabadhu) presentaron actividad selectiva, mientras que los 12 restantes fueron no selectivos y/o citotóxicos, siendo el más cito- tóxico el extracto de Cosumailo.
Ejije bid’u (DL50 = 65.5±25.3, CI50 T. cruzi = 9.1±1.5, CI50 Lma = 16.9±2.4µg/
mL, TIS=7.6 y LIS=4.3) e Id’ene eidhue (DL50 = 14.7±5.3, CI50 T. cruzi = 10.8±1.1, CI50 Lma = 10.4±0.2µg/mL, TIS=1.4 y LIS=1.4), fueron activos fren- te a los dos parásitos con valores de IS iguales o superiores a la droga control 2FQ. Sin embrago el último extracto (Id’ene eidhue) presentó un valor de TIS inferior al control natural 2FQ (TIS = 2.9), por lo que solo pudo ser conside- rado como leishmanicida selectivo con un valor de LIS igual al de la 2FQ (LIS
= 1.4). El extracto de Ejije bid’u fue el único considerado como anti-kineto- plástido selectivo, aunque nueve veces menos activo que el Nifurtimox (CI50
T. cruzi = 1.2±0.7µg/mL), presentó un TIS similar a este (TIS=7.7), fue casi dos
veces más leishmanicida que CAT (Lma = 29.1±9.0µg/mL) y presentó un valor de LIS casi el doble que el de la Miltefosina (LIS=2.5).
Adicionalmente, el extracto de Kuabadhu, inactivo frente a T. cruzi, resul- tó más activo y selectivo para Lma (CI50=18.2±0.3µg/mL, LIS=2.6) que la 2FQ (CI50=24.1±3.4µg/mL, LIS=1.4). Mientras que 2 de los extractos sin actividad antiparasitaria (Tse Buke Ina y Cayu) presentaron una elevada citotoxicidad (TIS y LIS < 0.7) y la planta Cosmailu presento valores de TIS (0.1) inferiores a la Doxorubicina (TIS 0.3) y fue el extracto más citotóxico.
El método fluorométrico de la resazurina nos permitió identificar productos naturales con actividad trypanocida y leishmanicida selectiva y disminuyó drásticamente, el número inicial de extractos con actividad antiparasitaria, demostrando las dificultades de encontrar, en el laboratorio, productos naturales eficaces y seguros, que permitan la obtención y desarrollo de nuevos agentes antiparasitarios. Al mismo tiempo, este nuevo protocolo nos permite ampliar el conocimiento sobre los metabolitos secundarios que hacen a nuestra biodiversidad facilitando la selección de especies con actividad citotóxica.
Método fluorométrico para identificar agentes naturales citotóxicos y su aplicación en la evaluación de agentes antiparasitarios selectivos
RAW 264.7 | T. cruzi | Lma | |||||
Especie Botánica | Nombre Tacana | DL50 | CI50 | TIS | CI50 | LIS | |
1 | Capsicum spp | Ejije bid'u | 69.5±25.3 | 9.1±1.5 | 7.6 | 16.0±2.3 | 4.3 |
2 | Cedrela spp | Kuabadhu | 46.6±1.6 | >50.0 | <0.9 | 18.2±0.3 | 2.6 |
3 | Tessaria integrifolia | Cawuara | 38.2±0.6 | 23.1±0.5 | 1.7 | 45.2±4.5 | 0.8 |
4 | Piper umbellatum | Sipu sipu | 13.7±1.2 | 8.9±1.7 | 1.5 | 11.9±0.4 | 1.2 |
5 | Hyptis brevipes | Id'ene eidhue | 14.7±5.3 | 10.8±1.1 | 1.4 | 10.4±0.2 | 1.4 |
6 | Philodendron undulatum | Uembe | 29.4±8.1 | 21.6±2.1 | 1.4 | 35.8±7.1 | 0.8 |
7 | Physalis angulata | Tomatillo | 11.9±0.6 | 11.6±0.5 | 1.0 | 21.0±0.1 | 0.6 |
8 | Jacaranda glabra | Cheperequi | 19.4±0.7 | 20.1±1.7 | 1.0 | 16.8±4.4 | 1.2 |
9 | Physalis spp | Tumati waichidhi | 20.3±1.5 | 25.5±8.8 | 0.8 | 43.9±8.4 | 0.5 |
10 | Lantana cf trifolia | Aquí djawa | 18.0±2.0 | 25.1±0.5 | 0.7 | >50.0 | <0.4 |
11 | Hyptis mutabilis | Tapacha ina | 9.3±0.1 | 14.5±4.0 | 0.6 | 23.2±8.6 | 0.4 |
12 | Scoparia dulcis | Bacua etse | 15±5.6 | 24.1±0.6 | 0.6 | 30.2±0.3 | 0.5 |
13 | Physalis pubescens | Cosmailu | 3.3±1.0 | 31.9±1.1 | 0.1 | 42.2±2.7 | 0.1 |
14 | Aphelandra cf. aurantica | Tse buke ina | 30.0±7.5 | >50.0 | <0.6 | >50.0 | <0.6 |
15 | Anacardium occidentale | Cayu | 36.2±1.3 | >50.0 | <0.7 | >50.0 | <0.7 |
CAT | 16.2±2.5 | 11.6±2.9 | 1.4 | 29.1±9.0 | 0.6 | ||
2-Fenilquinolina | 32.9±8.5 | 11.2±1.1 | 2.9 | 24.1±3.4 | 1.4 | ||
Benznidazol | 74.7±9.1 | 7.0±2.6 | 10.7 | - | - | ||
Nifurtimox | 9.2±2.1 | 1.2±0.3 | 7.7 | - | - | ||
Anfotericina-B | 13.8±3.7 | - | - | 0.3±0.1 | 46.0 | ||
Miltefosina | 25.3±8.1 | 1.2±0.7 | 21.2 | 10.2±4.4 | 2.5 | ||
Doxorrubicina | 0.3±0.1 | 0.9±0.2 | 0.3 | 10.4±6.5 | 0.03 | ||
LIS = Índice de selectividad para Leishmania TIS = Índice de selectividad para Trypanosoma
A los proyectos UMSA-ASDI: Bioprospección Tacana y Biomoléculas de Interés Medicinal e Industrial (75000553), por el apoyo financiero. Al CIPTA y CIMTA, por la planificación de los trabajos de campo en las comunidades Tacana. Al Instituto Sahlgrenska-Universidad de Gotemburgo-Suecia, por la donación de las células RAW 264.7. Uno de los co-autores (PTCI), fue becaria de Maestría del programa de fortalecimiento institucional UMSA-ASDI.
