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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 6: 15-25. JUNIO 2018. ISSN: 2310-0265
Evaluación de los indicadores de desempeño de 3M Petrifilm Staph Express (STX) frente a la norma ISO 6888-1: 2003 en el recuento de Staphylococcus aureus en quesos frescos por contaminación artificial
APAZA PACO, JUAN PABLO1 ASPILLAGA SÁNCHEZ, HILDA LUZ1 ESPADA SILVA, ANGÉLICA MARIA1
Evaluation of the performance indicators of 3M Petrifilm Staph Express (STX) against the ISO 6888-1: 2003 standard in the count of Staphylococcus aureus in fresh cheeses by artificial contamination.
FECHA DE RECEPCIÓN: 23 DE ABRIL DE 2018 FECHA DE ACEPTACIÓN: 11 DE MAYO DE 2018
Staphylococcus aureus puede contaminar una gran gama de alimentos, siendo los quesos frescos un medio diferencial y selectivo para el desarrollo de este microorganismo, llegando a la producción de enterotoxina termoestable ocasionando una intoxicación estafilocóccica trasmitida por alimentos.
Abstract
Staphylococcus aureus can contaminate a wide range of foods, being fresh cheeses a differential and selective medium for the development of this microorganism, reach- ing the production of thermostable entero- toxin causing a staphylococcal intoxication transmitted by food.
The use of the 3M Petrifilm Staph Ex- press (STX) method has considerable ad- vantages over the conventional or reference method, facilitating and favoring many tech- nical and economic aspects, within them we have the optimization of time as regards the preparation of culture media, need for equipment, infrastructure requirements, lower personnel requirements and decreas- es the costs of the use of electricity con- sumption, decreases the generation of solid waste, among others.
The comparison between the alterna- tive method and the conventional method
1 Instituto de Servicios de Laboratorios de Diagnóstico e Investigación en Salud, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés, Av. Saavedra 2224. La Paz, Bolivia.
Correspondencia autor: Apaza Paco Juan Pablo bio_juancho@hotmail.com
was made by means of the artificial contam- ination of a free matrix of S. aureus and a low accompanying microbiota count, where different levels of contamination were es- tablished, evaluating the performance indi- cators (relative accuracy, relative precision, linearity, calibration curve and limit of quan- tification).
In the relative accuracy indicator, 95.6% recovery was obtained for the lowest level (approximately 8 CFU / g) and 98.7% recov- ery for the highest level of contamination (approximately 5300 CFU / g), with a range of 70 to 120% acceptance. For the relative precision, the RSD of all the tested levels was calculated, obtaining data that accept the relative accuracy of the dry rehydratable plate method because the values were low- er than the calculated theoretical RSD. The limit of detection was tested with <10 CFU / g, obtaining a CV of 1.16%.
Based on the results obtained, we can conclude that the 3M Petrifilm Staph Ex- press (STX) method complies with the per- formance indicators against the ISO 6888-1: 2003 standard.
S. aureus, queso fresco, placa seca rehidratable, contaminación artificial.
KEY WORDS
S. aureus, fresh cheese, rehydratable dry plate, artificial contamination.
Staphylococcus aureus puede contaminar una gran gama de alimentos, llegando ocasionar un cuadro de intoxicación alimentaria que resulta tras la ingestión de enterotoxinas termoestables preformadas que son generadas por una cepa toxigénica de Staphylococcus aureus que contaminó y se desa- rrolló en un alimento. La incidencia es desconocida pero es probablemente una de las causas de intoxicación trasmitida por alimentos. Entre los alimen- tos más frecuentemente se encuentran: quesos frescos, huevos, pollo, cre- mas heladas (Bird et al., 2014). A nivel Latinoamérica, según datos recogidos del Sistema de Información Regional para la Vigilancia Epidemiológica de las ETA, durante el período 2012 -2016 han sido declarados 16 brotes de intoxi- cación estafilocóccica, con un total de 430 afectados sin fallecimientos. En 5 brotes se identificaron lácteos como alimento responsable, siendo carnes rojas y aves los restantes. Ocupa un papel destacado como agente etiológi- co de una de las gastroenteritis por intoxicación por consumo de alimentos contaminados. Esta afección se conoce como intoxicación alimentaria estafi- locócica (IAE) (Bird et al., 2013). S. aureus es la especie más característica del
género. Entre sus numerosos factores de virulencia se encuentran las entero- toxinas estafilocócicas (SE).
El empleo de las placas 3M Petrifilm Staph Express (STX) presenta ciertas ventajas frente al método convencional o de referencia, facilitando y favore- ciendo muchos aspectos técnicos y económicos, dentro de ellos tenemos la optimización de tiempo en cuanto se refiere a la preparación de medios de cultivo, uso de autoclave, baño de agua, material fungible, también disminu- ye los costos del consumo de energía eléctrica, entre otros.
En el presente trabajo se evaluaron los siguientes indicadores de desem- peño (límite de cuantificación, exactitud relativa, precisión relativa, linealidad y curva de calibración) considerada según ISO/TR 13843 como una validación interna o verificación por parte del laboratorio de control que va a utilizar el método alternativo, consiste básicamente en comprobar que el laboratorio es capaz de cumplir con los requisitos de funcionamiento del método previa- mente establecidos en las condiciones habituales de trabajo. Para poder rea- lizar lo descrito anteriormente, se ensayaron matrices con diferentes niveles de contaminación artificial con el analito de interés.
Se establecieron siete niveles de contaminación con la cepa de Staphylo- coccus aureus ATCC 29325 en la matriz libre del analito de interés. Para ello se procedió a la siembra de la cepa ATCC de Staphylococcus aureus en me- dio BHI, se incubo por 24 horas a 35°C, obteniendo un cultivo saturado, en continuidad se realizó diluciones seriadas hasta tener un recuento de 30 a 300 UFC/mL, conociendo la población aproximada se realizó el ajuste para poder obtener recuentos descritos en la tabla 1 según AOAC (2002).
Staphylococcus aureus ATCC 25923.
NIVEL | CONTAMINACION ARTIFICIAL | FORTIFICACIÓN (INTERFERENTES) |
0 | 0 UFC/g | 70 UFC/g |
1 | 8 UFC/g | 70 UFC/g |
2 | 20 UFC/g | 70 UFC/g |
3 | 34 UFC/g | 70 UFC/g |
4 | 90 UFC/g | 70 UFC/g |
5 | 112 UFC/g | 70 UFC/g |
6 | 270 UFC/g | 70 UFC/g |
7 | 1020 UFC/g | 70 UFC/g |
En una bolsa stomacher estéril, se procedió a pesar 25g de muestra, se rea- lizaron diluciones seriadas con agua peptonada llegando hasta un factor de dilución de 10-2. Hechas las diluciones se procedió a inocular la dilución 10-2 un volumen de 0,1mL por duplicado sobre la superficie de Agar Baird Parker, se distribuyó el inoculo con la ayuda de un asa de Drigalsky, posteriormen- te se incubaron las placas a 35°C durante 48hrs. Pasado este tiempo las colo- nias características de Staphylococcus aureus fueron sometidas a confirma- ción con la prueba de la coagulasa y DNasa.
Para realizar la prueba confirmatoria de la coagulasa se deben inocular cinco colonias típicas y cinco colonias atípicas en caldo BHI, incubarlo a 35°C por 24hrs. al cabo de este tiempo en un tubo estéril se pusieron 0,3mL de plasma y 0,1mL de cultivo, se homogenizo y se incubo a 35ªC por 6 horas, se realizaba la inspección cada 2 hrs.
En una bolsa de stomacher estéril, se pesaron 25 gramos de la muestra, posteriormente se agregaron 225 ml de agua peptonada obteniendo un fac- tor de dilución de 10-1, posteriormente se ubicaron las placas en una superfi- cie plana y lisa. Se elevó la lámina superior y se inoculo 1mL de la dilución en el centro de la placa Staph Express sin hacer burbujas, se aplicó el esparcidor plano en el centro de la placa para distribuir la muestra de manera uniforme, finalmente se incubaron las placas a 35°C por 24 horas donde se puede colo- car hasta 20 placas Staph Express una sobre otra.
Transcurrido el tiempo de incubación se contaron las colonias rojo-viole- tas. No se contó las colonias azules o verdosas.
Valor de referencia
* 100 =
Recuperación% =
Recuento obtenido
La exactitud, de los métodos se determinó mediante el porcentaje de re- cuperación, es decir, mediante el número de microorganismos que se re- cuentan en placas de Agar Baird Parker y 3M Petrifilm Staph Express (STX) comparando los recuentos obtenidos por ambos métodos, para ello se em- plea la siguiente formula:
Se calculó la recuperación de cada muestra analizada, empleando el promedio de los duplicados, y se obtuvo la recuperación total. Para que el método se considere exacto ha de cumplir que el porcentaje de recuperación se encuentre entre 70 y 120%.
A partir de las matrices contaminadas se definieron 9 niveles de concen- tración, cada nivel contaba con 6 repeticiones en condiciones de reproduci- bilidad y se estimó la desviación estándar de reproducibilidad (RSD), compa- rándolo con el del método de referencia o bien con el valor RSD teórico. La precisión del método es aceptable si es inferior o no se desvía en más de un 30% de la del método de referencia o la RSD teórica para cada nivel de inó- culo (ISO/TS 19036:2002).
RSD real = S RSD teórico = 1
X √ X
Para determinar la linealidad se trabajó con 6 niveles de contaminación ar- tificial del analito (0 UFC/g; 8 UFC/g; 34 UFC/g; 100 UFC/g; 1020 UFC/g; 5300 UFC/g) los ensayos fueron por duplicado, se ensayaron los tres métodos en paralelo para establecer su linealidad.
Para constituir una curva de calibración se trabajó en base a los datos ob- tenidos en el ensayo de linealidad donde se representara un gráfico donde el eje Y se encontraran los resultados obtenidos con el método alternativo (en valor logarítmico) y en el eje X el valor obtenido con el método de referencia (o con el material de referencia utilizado). En base a este gráfico se obtiene una estimación del método de regresión.
A partir de los mismos se hizo un estudio de regresión (Y=a+bx) en el que no solo debemos evaluar el coeficiente de correlación (r.) sino que se debe verificar que las hipótesis planteada en el trabajo se cumple (ejm.: los valores de la recta están dentro de un intervalo de confianza del 95%) evaluando de este modo la linealidad o defecto de ajuste (Aptitud del método para dar re- sultados que están en proporción con la cantidad de microorganismos pre- sentes en la muestra).
El límite de cuantificación se obtendrá a través del nivel crítico (menor cantidad que puede ser detectada (no nula) pero no cuantificada como un valor exacto. Para ello se seleccionaron tres niveles de microorganismos (mí- nimo, medio y alto) (0 UFC/g; 8 UFC/g; 30 UFC/g; 300 UFC/g) y se ensayaron cada uno de los niveles por seis oportunidades. Como dato importante, indi- car que la AOAC define el límite de cuantificación como aquella en el que el coeficiente de variación (S/X) debe ser inferior al 10%. El límite de cuantifica- ción puede estimarse mediante el análisis de diluciones (1:2 a ≤1:10) de bajas concentraciones de microorganismos, según AOAC equivale al nivel donde el coeficiente de variación es inferior al 10% (CV =Sr/X < 10).
En la figura 1, se puede observar los niveles de contaminación artificial que se realizaron para poder llevar adelante la evaluación de los indicadores de desempeño, dichos niveles contaban además con los microorganismos in- terferentes anteriormente citados, en la fila superior se observan los contro- les de los niveles ensayados y en la fila inferior se observan los niveles con la matriz contaminada.
En paralelo se inocularon las muestras fortificadas en medio Baird Parker como establece la norma ISO 6888-1:2003 (Figura 2); en las mismas se obser- vó el desarrollo de colonias típicas y atípicas que después fueron confirmadas por la prueba de la coagulasa y DNasa.
Como se puede observar en la tabla 2, la exactitud relativa que muestra el método de placa seca rehidratable que se representa por el porcentaje de re- cuperación, que fue calculado para cada nivel.
NIVEL | MEDIA±SD | % RECUPERACIÓN | VALORES ESPERADOS | ||
NIVEL | UFC/g | log UFC/g | |||
1 | 0,86 ± 0,0476 | 95,60% | 1 | 8 | 0,90 |
2 | 1,27 ± 0,0295 | 97,90% | 2 | 20 | 1,30 |
3 | 1,45 ± 0,0164 | 95,00% | 3 | 34 | 1,53 |
4 | 2,00 ± 0,0235 | 97,80% | 4 | 112 | 2,05 |
5 | 2,43 ± 0,0098 | 99,40% | 5 | 278 | 2,44 |
6 | 2,49 ± 0,0186 | 98,10% | 6 | 350 | 2,54 |
7 | 2,96 ± 0,0172 | 98,50% | 7 | 1020 | 3,01 |
8 | 3,68 ± 0,0288 | 98,70% | 8 | 5300 | 3,72 |
Como podemos en la Tabla 2, Se obtuvo un 95,6% de recuperación para el nivel más bajo (aproximadamente 8 UFC/g) y 98,7% de recuperación para el nivel de contaminación más alto (aproximadamente 5300 UFC/g), teniendo como promedio un valor de 97.6% de exactitud relativa.
Se stimó la desviación estándar de reproducibilidad (RSD), dicho valor se comparó con el RSD teórico. La precisión relativa del método es aceptable si es inferior o no se desvía en más de un 30% de la del método de referencia o la RSD teórica para cada nivel de inóculo (ISO/TS 19036:200). Como se puede observar la tabla 3, se calcularon la RSD de todos los niveles ensayados, ob- teniéndose datos que aceptan la precisión relativa del método de placa seca rehidratable porque los valores menores al RSD teórico calculado.
NIVEL | MEDIA ± SD | RSDt | RSDcal |
1 | 0,866 ±0,0127 | 1,0523 | 0,01467 |
2 | 1,27 ± 0,0048 | 0,8767 | 0,00378 |
3 | 1,45 ± 0,0013 | 0,8081 | 0,00090 |
4 | 2,00 ± 0,0023 | 0,7153 | 0,00115 |
5 | 2,43 ± 0,0003 | 0,6986 | 0,00012 |
6 | 2,49 ± 0,0019 | 0,6405 | 0,00076 |
7 | 2,96 ± 0,0013 | 0,5765 | 0,00044 |
8 | 3,68 ± 0,0034 | 0,5182 | 0,00092 |
La figura 3, muestra: a) la linealidad del método placa seca rehidratable y
curva de calibración en relación al método de referencia, obteniendo un R2= 0,9997 en la evaluación de la linealidad y un R2= 0,996 para la curva de calibración. Estas graficas se construyeron con los recuentos de 8 niveles, te- niendo concentraciones desde 0 UFC/g hasta los 5300 UFC/g dichos valores en UFC/g fueron transformados en valores de log de base 10, para poder rea- lizar el análisis estadístico de las tres metodologías.
Origen de las variaciones | Suma de cuadrados | Grados de libertad | Promedio de los cuadrados | F | Probabilidad |
Niveles | 49,953637 | 7 | 7,13623386 | 12,6367661 | 2,8814E-06 |
Métodos | 36,0347329 | 3 | 12,0115776 | 21,2699724 | 1,4355E-06 |
Error | 11,8591188 | 21 | 0,56471994 | ||
Total | 97,8474888 | 31 |
En la tabla 4, se muestra los resultados del análisis de varianza (ANOVA) de doble vía, niveles de concentración de Staphylococcus aureus y los métodos de recuento, donde se obtuvo un P< 0,05 para ambas vías, donde pone de manifiesto que no existe diferencia estadísticamente significativa
Se debe mencionar que la AOAC define el límite de cuantificación como aquella en el que el coeficiente de variación (S/X) es inferior al 10%. Al ob- servar la tabla 13, se muestra que el método placa seca rehidratable presen- ta un CV del 1,16%.
MÉTODO 3M PETRIFILM (STX) | MÉTODO ISO 6888-1 | |
0,9 | 0,7 | |
0,78 | 0,42 | |
0,85 | 0,7 | |
0,9 | 0,42 | |
0,9 | 0,7 | |
0,85 | 0,89 | |
Promedio | 0,86 | 0,64 |
SD | 0,01 | 0,17 |
CV% | 1,16 | 26,5625 |
Origen de las variaciones | Suma de cuadrados | Grados de libertad | Promedio de los cuadrados | F | Probabilidad |
Entre grupos | 0,35287778 | 2 | 0,17643889 | 9,52179649 | 0,00214003 |
Dentro de los grupos | 0,27795 | 15 | 0,01853 | ||
Total | 0,63082778 | 17 |
En la tabla 6, se muestra el análisis de varianza (ANOVA) de una vía, donde se obtuvo un P<0,05 donde pone de manifiesto que si existe diferencia esta- dísticamente significativa, resultado que concuerda con el cálculo del coefi- ciente de variación.
El recuento en placa seca rehidratable consiste en contar solamente las colonias violetas. Los fabricantes recomiendan un rango < a 100 UFC/g o mL, si el recuento supera las 150 UFC/g o mL de desarrollo debe ser reportado como muchas colonias por contar (MCP), es por ello que se realizaron dilu- ciones de los niveles 3; 4; y 5 para poder estar dentro de ese límite o también se puede optar por contar las colonias presentes en una cuadricula y multipli- carlo por 30, esto para poder tener un estimado o realizar más diluciones. En cambio por el método convencional se maneja un intervalo de recuento que oscila entre 25 a 250 UFC/g o mL.
Se obtuvo en promedio un valor de 97.6%, siendo aceptable por encon- trarse dentro del rango de 70-120%. Porcentajes similares se obtuvieron cuando Nogueira (2010) donde realizo la comparación entre el medio Baird Parker, agar plasma fibrinógeno de conejo y placa seca rehidratable para el recuento de Staphylococcus aureus en leche cruda. Sin embargo, el estu-
dio realizado por Nyachuba (2007) muestra un porcentaje de recuperación de 82,6% para el método de placa seca rehidratable y 92,5% para el méto- do referencia ISO. La razón por la cual se maneja la exactitud en porcenta- je, se debe porque no podemos manejar a los microorganismos como anali- tos químicos, su variación en número se puede deber a muchos factores, por un lado relacionados con la matriz a ensayar y por el otro lado las condicio- nes de laboratorio para poder realizar el recuento de este microorganismo en una matriz dada.
La precisión relativa del método del método es aceptable si es inferior o no se desvía en más de un 30% de la del método de referencia o la RSD teó- rica para cada nivel de inóculo (ISO/TS 19036:200). En la validación realiza- da el instituto científico de higiene y análisis (ISHA) en Marzo del 2015 se ob- tuvieron un RSD de 0.116 en método de referencia y un RSD de 0,074 para el método de placa seca rehidratable, siguiendo la normativa ISO 16140/A1 (2011). Los valores mencionados se relacionan con lo obtenido en el presen- te trabajo.
Los valores en UFC/g fueron transformados en valores de log de base 10, para poder realizar el análisis estadístico de las tres metodologías. Resultados similares se obtuvieron en la validación de marzo del 2015 por la ISHA, obte- niendo la certificación por la AFNOR (NF VALIDATION 16140™), sin embargo en ese estudio no se trabajó con una sola matriz, se validó el método con cin- co matrices diferentes como lo indica la ISO: 16140/A1 (2011).
El análisis de varianza (ANOVA) de doble vía, niveles de concentración de Staphylococcus aureus y los métodos de recuento, donde se obtuvo un P< 0,05 para ambas vías, Nogueira (2010) obtuvo valores de P<0,05 en el análi- sis estadístico de las pruebas que desarrollo comparando el método de placa seca rehidratable frente al medio Baird Parker y agar plasma fibrinógeno de conejo, la mejoría que presenta este método de recuento es la incorporación de un cromógeno que evidencia la presencia y facilita el recuento de las co- lonias de Staphylococcus coagulasa positivos.
Se debe mencionar que la AOAC define el límite de cuantificación como aquella en el que el coeficiente de variación (S/X) es inferior al 10%. Sin em- bargo podemos observar que los valores CV para la NB e ISO no serían acep- tados, esto se debe porque se ensayó un nivel de <10 UFC /g. se debe de to- mar en cuenta que el inoculo en la NB de 1mL esta fraccionada en tres (0.3mL; 0,3mL y 0,4mL) y en el caso de norma ISO, el volumen de inoculo es de 0,1mL. (Sí por ejemplo tenemos una matriz con 100 UFC/g, al hacer la dilución 10-1 solo se tendrá 10 UFC/g y de acuerdo a la norma ISO se siembre 0,1mL por duplicado, en este caso se tendría en la placa tendría que esperar el desarro- llo de una colonia de Staphylococcus aureus, recordando que las matrices ali- menticias cuentan con una microbiota variada, sin embargo el inoculo de la muestra en el método de placa seca rehidratable es de 1mL evitándose este fraccionamiento que conlleva a ser un punto crítico cuando no se cuenta con personal calificado.
Se comparó el desempeño del método 3M Petrifilm Staph Express (STX) frente al cultivo referido por la norma ISO 6888-1:2003 para el recuento Sta- phylococcus aureus en quesos frescos de elaboración artesanal por medio del ensayo de niveles de contaminación artificial. De acuerdo al análisis esta- dístico se obtuvo un P<0,05 que evidencia que sí existe diferencia estadísti- camente significativa.
Se determinaron los indicadores de desempeño por medio de la contami- nación artificial de la matriz seleccionada, obteniéndose una exactitud relati- va promedio del 97,6%, para la linealidad y curva de calibración se calculó un R2= 0,9997 y 0,996 respectivamente, de acuerdo al análisis de varianza de do- ble vía se obtuvo un P<0,05 concluyendo que si existe diferencia estadística- mente significativa; el límite de cuantificación que se estableció fue de 1,16%, valor que fue aceptado por ser < al 10% CV.
A la empresa 3M por proporcionarnos los insumos y al instituto SELADIS por brindarnos los ambientes para realizar el presente trabajo.
