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REVISTA CON-CIENCIA N°2/VOL. 5: 29-42. NOVIEMBRE 2017. ISSN: 2310-0265
Validación del método para la cuantificación de alcohol en sangre por cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama y espacio de cabeza y correlación con el método enzimático
TRIGO ORSINI, MYRIAM LINA1*
Validation of the method for the quantification of blood alcohol by gaseous chromatography with flame ionization detector and head and correlation space with the enzymatic method
FECHA DE RECEPCIÓN: 28 DE SEPTIEMBRE DE 2017 FECHA DE ACEPTACIÓN: 10 DE OCTUBRE DE 2017
The present study describes the standard- ization of the method for the quantification of alcohol in blood by Gas Chromatography with Flame Ionization Detector and headspace. The separation of the alcohol from a complex ma- trix such as blood was successfully carried out using an ELITE-1 column, the mobile phase or entrainment gas is a mixture of hydrogen and air, split injector and flame ionization detector. The method was validated with the fol- lowing parameters: specificity, linearity, pre- cision, accuracy, limit of detection and limit of quantification. The system fitness test was also performed. The method was alcohol specific, the response was linear in the range of 0.125 -
mg / mL analyte concentration. The value of the coefficient of variation or relative stan- dard deviation (C.V. or DSR) for precision was optimal. The mean recovery was 99.06%. And the limit of detection and quantification were
1 Facultad de ciencias Farmacéuticas y Bioquimicas Laboratorio Instituto de Investigaciones Fármaco. La Paz. Bolivia. Bioquímicas. Ins- tituto de Investigaciones Técnicas de la Universidad Policial “Mariscal Antonio José de Sucre”.
Autor de correspondencia: myriamtrigo@gmail.com
optimal for the quantification of blood alco- hol in the defined range.
Finally the chromatographic method was correlated with the enzymatic method (previ- ously validated) currently used in the Ethical Dosage Division of the Institute of Technical Investigations of the “Mariscal Antonio José de Sucre” Police University, through the sta- tistical analysis of the analytical responses of both methods a very good correlation was ob- tained by which it is concluded that the chro- matographic method can be used for the con- sequent purposes.
Validación, etanol, cromatogra- fía gaseosa, método cromato- gráfico, método enzimático.
KEY WORDS
Validation, ethanol, gas chromatography, chromatographic method, enzymatic method.
El alcohol etílico conocido popularmente como alcohol, es el componen- te fundamental de las bebidas embriagantes, el consumo permitido y social- mente aceptado lo convierte en una sustancia de abuso utilizada en la mayor parte de las culturas y épocas así como el tóxico universalmente más ingeri- do, lo cual origina una problemática que, en el caso de abuso en su consumo trasciende a lo social, sanitario, laboral y familiar.
Código Nacional de Tránsito contempla sanciones para aquellos conduc- tores que se encuentren en estado de ebriedad. Y el Decreto Supremo 420 establece el derecho a la vida y a la integridad física sancionando toda acción u omisión que tenga por objeto degradar la condición humana.
Como consecuencia de este problema el control de Alcoholemia por Cro- matografía Gaseosa y el desarrollo del método denominado ¨espacio de ca- beza¨ o más propiamente ¨de cámara de vapores en equilibrio con el líqui- do¨ resulta ser el procedimiento óptimo para la determinación del alcohol en sangre (REPETTO,M & REPETTO,G, 2009), debido a que constituye un método mediante el cual es posible separar, identificar y cuantificar el principio acti- vo de manera muy específica.
En el área forense los métodos clínicos (pruebas de consumo reciente de alcohol, pruebas de la pérdida de control de las facultades), y algunos méto- dos bioquímicos que emplean reacciones de óxido-reducción (Truhaut-Bou- déne, Newman, pentóxido de yodo, Nicloux) son aceptables como métodos presuntivos o de descarte; sin embargo actualmente es la cromatografía de gases el método de elección al ser altamente específico para el etanol y por
excelencia aceptado por su exactitud y precisión, por academias y organiza- ciones que velan por el cumplimiento de normas científicas en laboratorios analíticos que sirven a sistemas de justicia.
El método para determinar alcohol en sangre debe validarse y la valida- ción analítica es el establecimiento de evidencia documentada de que un procedimiento analítico conducirá, con un alto grado de seguridad, a la ob- tención de resultados precisos y exactos dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente establecidos. Que es exacto, preciso, selec- tivo, reproducible y que, por lo tanto es válido para realizar su determinación cuantitativa en la matriz biológica correspondiente. (Aguirre, 2001)
La validación de un método en el contexto del bioanálisis conlleva la acep- tación de una serie de características propias derivadas de la dificultad aña- dida que supone el hecho de tener que determinar analitos en muestras bio- lógicas complejas. Así por ejemplo, la aplicación de conceptos estrictamente estadísticos o bien la utilización de criterios de aceptación de resultados, está totalmente condicionada por la variabilidad intrínseca que supone la mani- pulación de muestras biológicas, no sólo desde la perspectiva de su análisis, sino también desde una visión más amplia que incluye su obtención a partir de animales o humanos y su almacenaje a una temperatura de congelación determinada. (Aguirre, 2001)
De acuerdo con la AEFI los parámetros que deben realizarse para la vali- dación de un método bioanalítico son: selectividad o sensibilidad, linealidad y rango, exactitud, precisión (repetibilidad, precisión intermedia), límite de detección y límite de cuantificación.
Una vez validado el método para la cuantificación de alcohol en sangre por Cromatografía Gaseosa con Detector de Ionización de Llama y Espacio de Cabeza, se procedió a la correlación de este método con el método en- zimático actualmente utilizado por la División de Dosaje Etílico del Instituto de Investigaciones Técnicas de la Universidad Policial “Mariscal Antonio José de Sucre”-IITCUP, mediante la correlación de las rectas de regresión con aná- lisis estadístico para determinar si el método enzimático puede ser utilizado como un método confiable, seguro, exacto y preciso para el control.
La presente investigación fue de tipo LONGITUDINAL RETROSPECTIVA.
Las muestra se constituyó en sangre fortificada a diferentes niveles de concentración de acuerdo a los requerimientos de Validación.
Los equipos utilizados fueron: un Cromatógrafo Gaseoso, Perkin Elmer, balanza analítica Sartorious, agitadores magnéticos con temperatura contro-
lada marca Fisatom, destilador de agua J.P. SELECTA, s.a. y sistema de purifi- cación de agua “Aqua MAX™”, Marca YOUNGLIN. Todos los materiales de vi- drio fueron: clase A
Los reactivos utilizados fueron: carbonato de potasio p.a., marca Riedel- de Haën (Lote:51820), agua ultrapura calidad HPLC, estándar Hidroalcohólico de trabajo de concentración 100g; 0,38g; 0,64g; 1,02g EtOH/L H2O, proveedor IBMETRO, lote: 5118451.01 y sangre humana recolectada por punción venosa (con H2O2 como desinfectante) en tubos vacutainer con EDTA.3K de volunta- rios sanos que no han ingerido alcohol.
Las condiciones cromatográficas utilizadas fueron: Un Cromatógrafo Ga- seoso, Perkin Elmer; una columna ELITE 1 (100% Dimetil polisiloxano), longi- tud 30 metros, diámetro interno 0,53 mm., espesor de película 3 μm. Rango de temperatura -60 a 260/280°C, marca Perkin Elmer; el detector de Ioniza- ción de Llama a 150°C; inyector Split a 150°C; volumen de inyección de 500μL (vapor) y las condiciones de trabajo: Temperatura inicial 35°C, 1 min y 10°C/ min de gradiente hasta 100°C de temperatura final.
Se prepararon estándares a diferentes concentraciones (0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 mg/mL) a partir de un estándar primario de 100 mg/mL. En un vial de 10 mL se colocó 1 mL de estándar de la concentración correspondiente y 1 mL de solución saturada de K2CO3, se introdujo en el vial un imán. Se tapó con tapón de goma y se precintó con aluminio, de tal manera que quede her- méticamente cerrado. El vial fue colocado en un baño maría en un agitador magnético a 50°C durante 30 minutos. Luego se tomaron 500 μL de aire con- finado en el vial y se inyectó en el cromatógrafo gaseoso.
Se prepararon 6 muestras sin interferencias (soluciones de estándares de trabajo) y 6 muestras con interferencias (soluciones de estándares de trabajo con matriz) a la concentración media de la curva de calibración (0,5 mg/mL).
Se prepararon 5 niveles de concentración, cada nivel con tres réplicas, para linealidad del método (analito + matriz).
Repetibilidad del sistema instrumental
Se determinó analizando repetidamente una misma muestra de forma consecutiva 6 veces, a la concentración media de la curva de calibración (0,5 mg/mL).
Repetibilidad del método
Se evaluó la repetibilidad del método preparando muestras fortificadas a tres niveles de concentración (0.125; 0.5; 1.0 mg/mL)
Precisión intermedia
La precisión intermedia mide la variabilidad del método en este caso se optó por días diferentes y analistas diferentes, realizando el análisis a la con- centración media de la curva en matriz fortificada y se calculó el coeficiente de variación total (CV).
Para evaluar la exactitud se prepararon 3 estándares por triplicado a con- centraciones de 0,125; 0,5 y 1,0 mg/mL y tres muestras fortificadas (matriz + analito) por triplicado a las mismas concentraciones de los estándares.
Para evaluar el límite de detección y cuantificación se prepararon tres concentraciones menores al punto más bajo de la curva de calibración, (0,1; 0,075 y 0,05 mg/mL) por triplicado y se determinó la curva de calibración para estas concentraciones.
Los parámetros de evaluación fueron los siguientes:
Precisión, expresada como el coeficiente de variación obtenido a par- tir de 5 inyecciones repetidas de solución de estándar de trabajo, según USP 37.
Parámetros cromatográficos: o Factor de capacidad,
Número de platos teóricos (N):
Factor de asimetría o de cola (tailing)
Límites de detección o cuantificación ((AEFI), 2001, pág. 107) (AGILENT, 2006).
La correlación de los métodos analíticos se realizó mediante la construcción de una curva de calibración con los datos (respuestas analíticas) obtenidos por ambos métodos en muestras fortificadas en todo el intervalo de Linealidad.
Se calculó el coeficiente de correlación, el coeficiente de determinación, cálculo de homogeneidad de varianzas y las hipérbolas de confianza.
Finalmente se comprobó la normalidad de residuales para lo cual se em- pleó la prueba de normalidad de Anderson-Darling.
a = | 297,48 | b = | 514,54 |
r = | 0,9954 | r2 = | 0,9908 |
Se observa que las respuestas son proporcionales a la concentración del analito y que el intervalo de trabajo es óptimo para realizar la alcoholemia
H(0)=. | s2 22 | H(1)= | s2 2 1≠s 2 | ||
Fexp= | 1,21 | F(0.05,5,5)= | 5,05 | Conclusión | Se acepta H(0) |
Existe homogeneidad de varianzas | |||||
Prueba de t de Student-Fisher de comparación de dos medias con grupos independientes, para varianzas homogéneas
H(0)= | μ1= μ2 | H(1)= | μ1≠ μ2 | ||
s(total)= | 13,23580 | ||||
texp= | 0,74 | t(0.05,10)= | 2,23 | Conclusión | Se acepta H(0) |
La matriz no es un interferente significativo | |||||
Una vez comprobada la homogeneidad de varianzas, se aplica la prueba de T de Student- Fisher en donde la prueba bilateral encuentra para una prueba de un riesgo α del 5% (0,05) que no existe diferencias significativas en la determina- ción de alcohol cuando se trabaja en presencia o ausencia de la matriz (sangre).
a = | 33,84160569 | b = | 2305,03821 |
r = | 0,997937241 | r2 = | 0,99587873 |
Las hipérbolas de confianza nos indican que todo el sistema (analistas, equipo, condiciones ambientales, material volumétrico, reactivos, etc) está funcionando de manera tal que no interfiere en la interacción entre la con- centración (x) y la respuesta analítica (y).
H(0)= | No hay correlación entre x e y | H(1)= | Hay correlación entre x e y | ||
t(0.05,n-2) | 2,16037 | Texp= | 56,04795 | Conclusión | Se rechaza H(0) |
r2*100 = | 99,587 | % de los pares de datos se ajustan a la recta | |||
El coeficiente de correlación (r) nos indica el grado de relación entre la va- riable (x) y la variable (y), existiendo correlación con una probabilidad ele- vada como se observa en las tablas.
El coeficiente de determinación (r2) expresa la proporción de la variación total de la respuesta (y-área) explicada por el modelo. El intercepto ordena- da en el origen no difiere estadísticamente de cero. Las varianzas de las con- centraciones son homogéneas, y el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados.
En el análisis de varianza para la regresión y linealidad, comprobándose previamente que se cumplen los supuestos de homogeneidad de varianzas y normal de los residuales, se demuestra la existencia de una pendiente esta- dísticamente diferente de cero y una falta de ajuste en las concentraciones.
RESPUESTA ANALÍTICA | TIEMPO DE RETENCIÓN | |
COEFICIENTE DE VARIACIÓN(%) | 0,707911761 | 0,312501014 |
INTERPRETACIÓN | Repetibilidad del instrumento en respuesta analítica | Repetibilidad del instrumento en tiempos de retención |
CRITERIOS DE ACEPTACIÓN (CV) | no más de 2% | |
RESPUESTA ANALÍTICA | RELACIÓN |
PROMEDIO | 2387,258889 |
COEFICIENTE DE VARIACION(%) | 5,709160968 |
Criterio de aceptación: CV(%) no más de 15 % | |
ANALISTA X | DIA 1 | DIA 2 | DIA 3 |
CV(%) | 0,50 | 1,21 | 2,21 |
DIA 1 | DIA 2 | DIA 3 | |
CV(%) | 0,21 | 0,31 | 0,68 |
Conclusión | |||
CV TOTAL | 1,4 | Precisión intermedia aceptable | |
H(0)= | s2 2 1=s 2 | H(1)= | s2 2 1≠s 2 | ||
Gexp= | 0,7220 | G(0.05,k,n)= | 0,8709 | Conclusión | Se acepta H(0) |
El factor de concentración no influye en la variabilidad de los resultados | |||||
H(0)= | Recup. Media = 100 | H(1)= | Recup. Media ≠ 100 | ||
texp= | 0,99763 | t(0.05,n-1)= | 2,30600 | Conclusión | Se acepta H(0) |
No existe diferencia significativa entre la recuperación y 100. Por tanto es un Método exacto | |||||
La exactitud se expresa como porcentaje de recuperación de la diferencia entre la media obtenida y el valor aceptado como verdadero, y en este caso la recuperación es satisfactoria ya que aplicando una prueba de t de Student el valor texperimental < ttablas, no habiendo diferencia significativa entre la recuperación media y el 100%, por lo que la exactitud es correcta.
UNIDADES | ||
LÍMITE DE DETECCIÓN | 0,011705112 | mg/mL |
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN | 0,022843384 | mg/mL |
Los límites de detección y cuantificación encontrados demuestran clara- mente que el método puede ser aplicado para la determinación de alcohol en sangre
Los parámetros cromatográficos calculados demuestran que el sistema es apto para la determinación de alcohol en sangre
Límites de detección y cuantificación.- Fueron calculados en la Valida- ción del método
a = | 62,2905817 | b = | 1738,12917 |
r = | 0,9969 | r2 = | 0,9939 |
La relación de las respuestas de las muestras tratadas por el método en- zimático (x-variable independiente) y las respuestas de las muestras tratadas por el método cromatográfico (GC) (y-variable dependiente) se expresa ma- temáticamente como una recta de regresión (y=bx+a) obtenida por un méto- do de ajuste, en este caso mínimos cuadrados. Con lo cual se pudo compro- bar que existe una buena correlación entre ambos métodos.
De acuerdo a los resultados obtenidos se puede concluir que:
El método estandarizado y validado para la cuantificación de alcohol en sangre por Cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama y espacio de cabeza es rápido, sencillo y económico en relación a otros encontrados en la literatura, resultando una alternativa eficien- te para el análisis en el campo forense.
Se validó el método analítico para la cuantificación de alcohol en san- gre por cromatografía gaseosa en el Instituto de Investigaciones Fár- maco Bioquímicas (IIFB) de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas de la UMSA, con lo que se comprobó que éste cumple con todos los requerimientos exigidos en el protocolo. Por lo tanto, se puede asegurar que la metodología se encuentra en condiciones de ser utilizada para el análisis rutinario de determinación de etanol en san- gre lo que garantiza resultados confiables y reproducibles con aplica- ción en las pericias forenses.
El método luego de la validación resultó específico ya que es capaz de medir de manera inequívoca el analito, lineal, preciso y exacto.
Los límites de detección y cuantificación son muy bajos, sin embargo no se puede determinar claramente los niveles de alcohol endógeno.
El método para la cuantificación de alcohol en sangre por Cromato- grafía gaseosa con detector de ionización de llama y espacio de cabe- za presenta correlación estadística con el método enzimático utilizado en la División de Dosaje Etílico del Instituto de Investigaciones Técni- cas de la Universidad Policial “Mariscal Antonio José de Sucre”.
Agilent. (s.f.). Recuperado el 18 de 12 de 2015, de http://www.agilent.com
AGILENT. (2009-2010). www.agilent.com. Recuperado el 03 de Febrero de 2016, de http://www.agilent.com/che/supplies
(2010). Recuperado el 12 de Marzo de 2016, de http:www.chomacademy.com.