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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 5: 11-25. JUNIO 2017. ISSN: 2310-0265
Establecimiento y evaluación de dos métodos de pre tratamiento de muestras de suelo para la extracción de ADN para el estudio de la diversidad bacteriana
Establishment and evaluation of two methods of pre-treatment of soil samples for the extraction of DNA for the study of bacterial diversity
DONAIRE FIGUEROA, KAREM1 PEREZ DUVAL, ANGELA1
ROMERO CALLE, DANITZA XIOMARA1
CÁRDENAS ALEGRÍA, OSCAR1 ÁLVAREZ ALIAGA, MARÍA TERESA1
FECHA DE RECEPCIÓN: 9 DE FEBRERO DE 2017 FECHA DE ACEPTACIÓN: 2 DE MAYO DE 2017
La necesidad de ampliar los conoci- mientos respecto a los mecanismos bioquí- micos y fisiológicos desarrollados por los microorganismos presentes en suelos re- quiere de una descripción completa de la diversidad microbiana, para lo cual en las últimas décadas se han desarrollado dife- rentes técnicas moleculares (qPCR, DGGE, T-RFLP, RAPD.) las mismas que requieren una adecuada técnica de extracción de ADN que aseguren el éxito de la descripción de la diversidad microbiana, considerando las características de las muestras de suelos a ser estudiadas.
Los protocolos de extracción de ADN ge- neralmente utilizados están basados en la se- paración de los microorganismos de la matriz antes de la extracción de ADN mediante lisis física o química y por otro lado, la extracción directa del ADN microbiano a partir de mues- tras de suelo, sin embargo la presencia de sus- tancias húmicas y fenólicas afectan la calidad
Abstract
The knowledge about biochemical and physiological mechanisms by micro- organisms in soils are required for a com- plete description of microbial diversity, lately different molecular techniques have been developed to study this feature (qPCR, DGGE, T- RFLP, RAPD). DNA extraction techniques ensure the description of the mi- crobial diversity success, according the soil samples characteristics.
Generally, DNA extraction protocols used for separation of microorganism of matrix soil before DNA extraction by physi- cal and chemical lysis. Other protocol is di- rect extraction of microbial DNA from soil samples, humic acids and phenolic sub- stances affect the quality of DNA, which af- fect the development of subsequent molec- ular studies.
The purpose of this study was to estab- lish pretreatment procedures for different kind of soil samples (frank, sandy and clay-
1 Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas (IIFB), Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, UMSA.
del ADN extraído, lo que repercuten en el de- sarrollo de posteriores estudios moleculares. La finalidad de este estudio fue la de es- tablecer procedimientos de pre tratamientos de 3 tipos de muestras de suelo (arenoso, ar- cilloso y francos) para posteriormente descri- bir la riqueza y diversidad bacteriana de las muestras en estudio mediante PCR DGGE. De esta manera se determinó que la adición de CaCO3 en muestras de suelos francos permi- te la identificación de una mayor diversidad y riqueza bacteriana (10 bandas). Asimismo, la adición de PVPP a suelos arenosos (8 bandas) y arcillosos (3 bandas) también permite obte- ner las características descritas anteriormente utilizando el método PCR-DGGE. Lo cual indi- ca que los procedimientos de pre tratamiento con CaCO3 y PVPP son específicos para la ex- tracción de ciertas comunidades microbianas.
ey) in order to describe richness and bac- terial diversity by PCR DGGE. In this sense, we determined the addition of CaCO3 in frank soils samples allows the identifica- tion of greater diversity and bacterial rich- ness (10 bands) than the other method. Be- sides, PVPP pretreatment is no only useful to obtain bacterial diversity in sandy soil (8 bands), but also in clayey soils (3 bands) soils by PCR-DGGE method. This indicates that the pretreatment procedures with CaCO3 and PVPP are specific for soil microbial community’s isolation.
KEY WORDS
Bacterial diversity, PCR DGGE, DNA extraction, pretreatment of soils.
Las comunidades microbianas desempeñan un rol crítico en procesos bio- geoquímicos, interactúan con las raíces de las plantas y también son constitu- yentes del suelo en la interface raíz-suelo. Los microorganismos promotores del crecimiento vegetal desempeñan un papel clave en la toma de nutrientes, siendo también esenciales para el desarrollo de otros organismos y el man- tenimiento de la salud radicular, favoreciendo de esta manera la producción agrícola. Entre estos microorganismos, se encuentran las denominadas bac- terias promotoras de crecimiento vegetal las mismas que son benéficas para el desarrollo de la planta, tolerancia a estrés ambiental, descomposición de la materia orgánica, la mineralización de nitrógeno, fósforo, azufre, produ- ciendo además componentes bioactivos como vitaminas, hormonas y enzi- mas (Rashedul et al, 2012, Roose et al, 2001; Escalante et al, 2004, Coleman 2004, Rives et al, 2007 y Sagova, et al, 2008). Asimismo, estas bacterias benéfi- cas, desintoxican el suelo de pesticidas, suprimen las enfermedades de plan- tas, inhibiendo el crecimiento de microorganismos patógenos del suelo, que son aquellos que pueden inmovilizar nutrientes, producir toxinas, sustancias pútridas que afectan el crecimiento y salud de las plantas. (Higa et al 1995). En este sentido se hace perentorio contar con una descripción más completa de la diversidad microbiana lo que posibilitaría ampliar nuestro conocimien- to sobre los mecanismos bioquímicos y fisiológicos desarrollados por los mi- croorganismos (Escalante et al, 2004).
Tradicionalmente los estudios para caracterizar la diversidad bacteriana en diferentes ambientes se basan en la suposición de que las técnicas de cul- tivo permiten recuperar la mayor parte de las comunidades bacterianas pre- sentes en una muestra. Sin embargo, únicamente entre 0.1 y 10% de las bac- terias en el ambiente son cultivables. No hay una explicación satisfactoria para entender la baja proporción de bacterias cultivables, y este fenómeno ha sido una seria limitación para estudiar la diversidad microbiana del suelo (Escalante et al., 2004).
Actualmente, existen herramientas o técnicas moleculares de la ingenie- ría genética o de la tecnología del ADN recombinante (Bolívar, 2004) que per- miten la extracción, aislamiento, modificación y caracterización del ADN de cualquier organismo. Estas herramientas son fundamentales para compren- der un número importante de procesos biológicos, estudio de la diversidad biológica en muestras ambientales (Boon et al., 2002; Lyautey et al., 2005; McIntosh et al., 2008), muestras de alimentos (Ampe et al., 1999; Ercolini, 2004) y además son técnicas útiles soportando el estudio de las comunidades microbianas en el suelo, favoreciendo de esta manera investigaciones agro biológicas que aportan al desarrollo de la agricultura dentro de un contex- to multifactorial y multidisciplinario (Schneegurt et al, 2003; Escalante et al, 2004; Zaporozhenko et al, 2006). Dentro de estas técnicas podemos mencio- nar técnicas moleculares que han sido desarrolladas ampliamente como ser Reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (qPCR), Microarray, elec- troforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), y técnicas molecula- res de huellas genéticas (T-RFLP, RAPD) (LaMontagne, et al, 2002).
Con la finalidad de describir la riqueza y diversidad microbiana de ecosis- temas de suelos, numerosos procedimientos para el aislamiento y purifica- ción de ADN han sido descritos (Sagova et al, 2008), debido a la complejidad relacionada a la heterogeneidad de las muestras. Se ha descrito que los dife- rentes tipos de muestras de suelos revelan una variación en cuanto al rendi- miento del ADN, los factores que influyen al rendimiento son: 1) la diferencia entre métodos permite recuperar diferentes cantidades de ADN de diferen- tes especies, es así que el rendimiento es afectado por la especificidad del método, 2) la presencia de diferentes organismos a las bacterias y diferentes especies bacterianas, 3) finalmente el bajo rendimiento del ADN puede ser atribuido a la unión del ADN a ciertas partículas, tales como la arcilla y el hu- mus estas partículas se encuentran cargadas negativamente, que facilita su unión a cationes de intercambio iónico; asimismo, sucede con la arcilla y la materia orgánica que pueden adsorber el material genético libre y/o degra- darlo (Sagova et al, 2008). Lo que implica que la extracción de ADN a partir de la compleja matriz del suelo, representa una variedad de sustancias que pue- den inhibir la actividad polimerasa, enzimas de restricción e incluso interfe- rir con la hibridación.
Asimismo, la eficiencia de la extracción de ADN de los microorganismos presentes en el suelo depende del contenido celular, las características físico químicas pH, contenidos de materia orgánica (ácidos húmicos), contenido de arcilla, además agua, calcio entre otros, son factores importantes que influ-
yen para obtener un protocolo de purificación y extracción eficaz (Sagova et al, 2008; Rhashedul et al, 2012). Para el aislamiento de ácidos nucleicos se re- curre frecuentemente al uso de kits comerciales para la extracción de ADN de suelos y sedimentos como ser Favorgen, Power Soil DNA Isolation (Mobio), NorgenBiotek y UltraClean soil DNA (Hill et al.,2000; Martin et al., Diez et al., 2001, Castañeda et al, 2004; Tanase 2015).
Sin embargo, el rendimiento de la extracción de material genético con el empleo de estos kits puede ser bajo existiendo perdidas de comunidades mi- crobianas durante el proceso de purificación, podría presentar una deficiente purificación proteica y de compuestos fenólicos que aun inhiben la amplifi- cación del ADN y el costo de adquisición de estos kits. En consecuencia, exis- te la necesidad de adecuar y/o diseñar técnicas de extracción de ADN que aseguren el éxito de la PCR y posteriores estudios moleculares, consideran- do las características de las muestras (Robe et al., 2003; Pakpour, et al., 2013) y que las mismas sean apropiadas para el estudio de ecosistemas complejos tales como los suelos.
Los protocolos de extracción de material genético a partir de muestras de suelo pueden ser clasificados en dos grupos: 1) Separación de los microor- ganismos de la matriz antes de la extracción de ADN mediante lisis física o química y, 2) Extracción directa del ADN microbiano a partir de muestras de suelo.
El presente trabajo tiene por finalidad es optimizar la extracción directa de material genético de microrganismos a partir de 3 tipos de muestras de sue- lo (arenoso, arcilloso y francos), incluyendo dos procesos de pre-tratamiento de las muestras consistentes en la adición de carbonato de calcio y de PVPP (polivinilpolipirrolidona), para posteriormente describir la riqueza y diversi- dad bacteriana de las muestras en estudio mediante PCR DGGE.
Se colectaron tres tipos de muestras de suelos en tubos Falcón de 50 ml: i) suelo francos, recolectado de un barranco en la zona Santa Rosa Grande (La Paz), ii) suelo arenoso, recolectado de la zona Villa Fátima (La Paz) y iii) sue- lo arcilloso, mismo que fue adquirido de una librería Paty. Posteriormente, las muestras fueron homogenizadas, tamizadas y secadas en mufla a 50 °C du- rante 24 horas.
Las muestras de suelo fueron sometidas a dos tipos de protocolos de ex- tracción y purificación de ADN.
Extracción y purificación de material genético a través del Kit comercial Favorgen
Las extracciones de material genético de las muestras de suelos fue- ron procesadas utilizando el protocolo establecido por el Kit Favorgen por triplicado. Se adicionó 0,5 g de muestra de suelo en cada tubo ep- penddorf que contenía 200 mg de perlas de vidrio y 600 μl de tampón de SDE1, las mezclas fueron homogenizadas durante 5 min y fueron in- cubadas a 70 °C durante 10 minutos. Durante la incubación las suspen- siones fueron homogenizadas cada 5 min., posteriormente, los tubos eppendorf se centrifugaron a 14 000 rpm durante 5 min, se añadió 200 μl de tampón SDE2 a las suspensiones y se mantuvieron las muestras en baño de hielo durante 5 min. Consecutivamente, los tubos fueron centrifugados a 14 000 rpm durante 5 min, los sobrenadantes fueron transferidos a otros tubos eppendorf 1,5 ml, se adicionaron 1 volumen de isopropanol y centrifugaron a 14 000 rpm durante 10 min. Se elimi- nó cuidadosamente los sobrenadantes, para lo cual se invirtieron los tubos sobre papel toalla durante 1min y se añadió 200 μl de tampón de elución precalentado. Subsecuentemente, a las suspensiones se adi- cionó 100 μl de tampón SDE3, se homogenizó e incubó a temperatu- ra ambiente durante 3 min y se centrifugó a 14 000 rpm durante 2 min. Los sobrenadantes fueron transferidos a otros tubos eppenddorf y se adicionaron 1 volumen de buffer SDE4 y 250 μl de etanol al 70 %. Las suspensiones obtenidas fueron colocadas en columnas SDE, se centri- fugaron por 1 min y la soluciones eluídas fueron eliminadas. Las colum- nas SDE fueron transferidas a otros tubos eppendorf, se añadió 750 μl de tampón de lavado a las columnas SDE y se centrifugaron a 14 000 rpm por 1 min, se descartó las soluciones eluídas, este procedimiento se realizó tres veces. Consecutivamente, los tubos fueron centrifuga- dos a 14000 rpm durante 3 min. Se trasvasó las columnas SDE en tubos eppenddorf, se añadió centro de la membrana de la columna de SDE 200 μl de tampón de elución precalentado. Finalmente, las columnas SDE fueron incubadas a temperatura ambiente por 2 min y fueron cen- trifugadas a 14 000 rpm.
Extracción y purificación de material genético a través de lisis celular directa sin pre-tratamiento
Se pesaron 0,5 g de cada muestra de suelo en tubos eppendorf, se- guidamente se adicionaron 700 μL de buffer de lisis [100 mM de Tris- HCl, 100 mM de EDTA pH=8, 100 mM de fosfato de sodio di hidratado,
1.5 % hexadecyl methyl ammonium bromide (CTAB) pH=8] y 50 μL de proteinasa K (10 mg mL-1) (Fatima et al., 2011). Las suspensiones fueron sometidas a agitación constante a 225 rpm por 45 min a 37 ºC, transcu- rrido ese tiempo se adicionó 150 μL de SDS al 20% y 50 μL de lisozima (10 mg mL-1), las suspensiones fueron nuevamente sometidas a agita- ción a 750 rpm durante 2 horas a 65 °C y se centrifugó a 8500 rpm por 10 min. Los sobrenadantes fueron trasvasados a tubos eppendorf nue- vos y al pellet se adicionó 200 μL de buffer de lisis con 30 μL de SDS al
20% y se incubó a 750 rpm por 15 min a 65 °C. Posteriormente, los so- brenadante fueron trasvasados a otros tubos eppendorf y el pellet fue eliminado. A las suspensiones colectadas se adicionaron 1 volumen de cloroformo: alcohol-isoamílico (24:1) incubándose a 20 º C durante 20 minutos y consecutivamente se centrifugaron a 10 000 rpm por 10 min. Los sobrenadantes fueron trasvasados a otros tubos eppendorf y se adicionó 1 volumen de isopropanol a cada uno de los tubos y se man- tuvo en baño de hielo por 20 min. Nuevamente se centrifugaron los tu- bos a 14 000 rpm por 15 minutos y se eliminaron los sobrenadantes. Consecutivamente, a los pellets se adicionaron 200 μl de etanol al 70%, se centrifugaron los tubos a 14 000 rpm por 3 min, los sobrenadantes fueron eliminados y el ADN obtenido de cada tubo eppendorf fue se- cado a 55 ºC. Finalmente se adicionaron 200 μl de buffer TE y los tubos fueron conservaron a -20 °C hasta su utilización.
Para realizar la purificación de ADN se utilizaron columnas que contenían papel filtro Whatman 0.5, algodón y Sephadex G100.
Preparación de las columnas: se utilizaron columnas de 1.25 cm de diá- metro (jeringa de 5ml), se colocó papel filtro Whatman 0.5 en el inte- rior de la columna junto con algodón y 1.5 mL Sephadex G 100 (sus- pensión de 2.1 g/10 mL de buffer TE).
Elución del ADN: se realizaron 3 lavados de las columnas con buffer TE a través de la presión ejercida con el embolo de la jeringa, se adicionó 200 μl del ADN extraído a cada columna. El ADN eluido fue colectado en un tubo eppendorf. Además, descartando la suspensión de Sepha- dex G 100 de las columnas, tanto el algodón como el papel filtro fueron colocados en un vial que contenía 3 ml de buffer TE, se incubó duran- te 15 min y posteriormente el contenido de los viales fue transvasado a tubos eppendorf. En ambos, en la solución de ADN eluido y en la so- lución ADN recuperado mediante el lavado con buffer TE, se añadió un volumen de isopropanol, se mantuvo en baño de hielo por 20 min, posteriormente los tubos fueron centrifugados a 14 000 rpm por 15 mi- nutos, se eliminó el sobrenadante y se adicionó 200 μl de etanol al 70%, se centrifugó a 14 000 rpm por 3 min, y se eliminó el sobrenadante. El ADN obtenido fue deshidratado a 55 º C, finalmente se adicionó 200 μl de buffer TE y conservó a -20 °C.
Extracción y purificación de material genético a través de lisis celular directa con pre-tratamientos
Pre- tratamiento con carbonato de calcio
Se pesaron 0.5 g de cada muestra de suelo en tubos eppendorf y se adicionaron 500 μL de CaCO3 1M y se incubaron a temperatura am-
biente durante 1h, posteriormente los tubos eppendorf fueron centri- fugados a 8500 rpm por 10 min y los sobrenadantes fueron eliminados (Cermak et al, 2008).
Pre- tratamiento de PVPP
Se pesaron 0.5 g de cada muestra de suelo en tubos eppendorf y se adicionó 1 volumen de polivinilpolipirrolidona (PVPP) al 1%, los tubos fueron sometidos a agitación constante en shaker orbital a 100 rpm por 15 min y finalmente se eliminó el sobrenadante.
Consecutivamente a ambos pre- tratamientos, se estableció el proce- dimiento de extracción y purificación modificado de acuerdo a los au- tores Sharma et al., 2007 y Wang et al., 2008.
A partir de las distintas muestras extraídas y purificadas de ADN se am- plificaron por PCR fragmentos del gen codificante región variable V3 del 16S ARNr. Se utilizaron primers denominados 341F-GC clamp (5´-CCT ACG GGA GGC AGC AG CGC CCGCCGCGC CCC GCGCCC GTC CCGCCGCCC
CCGCCC-3´) y 534R (5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’) que amplifican una región de 234pb. Se utilizó 20 μL de mix para la amplificación, [0.03 UμL-1 de Taq polimerasa, 1x de buffer, 0.8 μM de cada primer, 0.2 mM de dNTPs, 1.5 mM de MgCl2, 0.5 mg mL-1 de albúmina de suero bovino (BSA)] y 5 μg mL-1 de ADN. Las condiciones de amplificación del ADN por PCR fueron: Desna- turalización inicial a 94 °C por 10 min, seguida de 15 ciclos de Desnaturaliza- ción a 94°C por 1 min, Alineamiento a X°C por 1 min, (X representa la tempe- ratura de alineamiento en la cual se disminuye 2 °C desde 66 °C hasta 52°C, la disminución de la temperatura de alineamiento se estableció cada 3 min) y Elongación de la cadena a 72°C por 3 min. Consecutivamente, nuevamente 15 ciclos de Desnaturalización a 94 °C por 1 min, Alineamiento a 55 °C por 1 min y Elongación de la cadena a 72 °C por 3 min y finalmente, la Elongación final a 72 °C por 10 min. Para cada reacción se utilizó un control negativo equivalen- te a un volumen de agua destilada estéril (Wang et al, 2008). Posteriormente se realizó la corrida electroforética en geles de agarosa al 1.5%.
Para separar los distintos fragmentos amplificados de la región variable V3 del 16S ARNr, se realizó una electroforesis en gel con gradiente desnaturali- zante (DGGE) utilizando un gradiente de urea-formamida siguiendo las indi- caciones descritas por Muyzer et al.,1998.
Se prepararon geles de poliacrilamida al 8 % (v/v) con diferentes gradien- tes desnaturalizantes de urea-formamida de 40 a 60%, (100% de desnatura- lizante definido como: 7 M de urea y 40% de formamida desnaturalizante),
acrilamida bis acrilamida (37.5:1) al 8%. En cada pozo del gel se sembraron 10 μl del producto de amplificación y la electroforesis se realizó a 60 V durante 7 horas en buffer TAE 1x colocado en el tanque de electroforesis a 60 °C (As- cher et al., 2004). Los geles de poliacrilamida fueron revelados utilizando la tinción de nitrato de plata (Sánchez, 2015).
Se realizó correlación de Spearman para determinar la relación entre el tipo de suelo y procedimiento de extracción, análisis Kruskal-Wallis (p<0,05), para establecer las diferencias entre el rendimiento, índices de pureza, tipo de muestras y procedimiento de extracción de ADN, análisis Kruskal-Wallis (p<0,05) para identificar la diferencia entre el número de bandas obtenidas mediante el PCR-DGGE y procedimientos de extracción empleados, se reali- zó análisis de clúster método UPGMA para determinar la similitud en la com- posición de las comunidades entre los distintos tipos de suelo. Estos análisis se realizaron utilizando el software R Project.
La eficiencia de la extracción y purificación depende de las características físicas químicas de la muestra, la elección del protocolo debe estar relacio- nada al rendimiento y la calidad del material genético obtenido, además este debe ser representativo de toda la comunidad microbiana presente en el ni- cho ecológico en estudio. La extracción del material genético dependerá del tipo de muestra de suelo (Niemi et al, 2001; Schneegurt et al, 2001; Robe et al, 2003; Young et al, 2014).
En el presente estudio inicialmente se desarrollaron dos protocolos de ex- tracción, en el primer protocolo se realizó utilizando un método modificado y otro mediante el Kit Favorgen. Mediante el DGGE se determinó una sola banda utilizando el Kit Favorgen y mediante el protocolo de extracción mo- dificado se obtuvo hasta tres bandas en muestras de suelos francos (Figura 1 y tabla 1). Es así, que se adicionó dos procedimientos a la extracción de ma- terial genético modificado; a) pre tratamiento con carbonato de calcio y b) pre tratamiento con PVVP para obtener un mayor número de bandas, es de- cir determinar mayor cantidad de géneros o especies bacterianas. Utilizando el pre tratamiento con carbonato de calcio se obtuvo hasta diez bandas en muestras de suelo arenosos.
Obtención de material genético por el uso del Kit comercial Favorgen y a través de lisis celular directa sin pre-tratamiento
Para evaluar la pureza del material genético obtenido de las muetras de suelo, se determinó los indices de pureza (IP), según las siguientes re- laciones de absorvancias: A260/230 (Ácidos nucleicos/Ácidos húmicos) y A260/280 (Ácidos nucleicos /proteína). Si el IP A260/230 es superior a 2 indica una pureza ideal de ADN, valores inferiores representa conta- minación por ácidos húmicos. La relación A260/280 mayor a 1.8, impli- ca un ADN puro libre de proteínas (Liesack et al, 1997; Bürgmann, et al; 2001; Fátima et al, 2011). En este sentido, el procedimiento propuesto para la extracción de ADN bacteriano a partir de las muestras en estu- dio, no remueven completamente los acidos húmicos y/o compuestos fenolicos incluyendo el kit comercial. Por otro lado, la contaminación por proteinas en la mayoría de los casos fue inferior a 1.8 a excepción excepcion de las muestras S2 y S3, como se observa en la tabla 1.
Además, no se identificó diferencias significativas entre el tipo de muestra, tipo de procedimiento, IP de A260/230, IP de A260/280 y ren- dimiento de ADN (Kruskal Wallis, p>0,05). Sin embargo, el procedi- miento empleado de acuerdo el pre tratamiento dependera de la na- tureleza de la muestra o tipo de suelo empleado.
Con respecto al rendimiento de ADN, el mayor obtenido fue de 27.7 μg/g (S2) y el menor rendimiento fue de 4.16 μg/g en (P3), las muestras pre tratadas con carbonato de calcio a excepción de suelos arenosos, mostró los mejores rendimientos en suelos francos y arcillosos, el aná- lisis ha sido calculado los valores de la media por triplicados (figura 1 y tabla 1).
En este trabajo se utilizó la lisis directa, debido a que es más rápido, se obtiene mayor rendimiento de ADN y es representativo de la comuni- dad microbiana presente en la muestra. Sin embargo, existen desven- tajas de este método como ser las extracciones adicionales de compo- nentes orgánicos tales como ácidos húmicos, compuestos fenólicos, aromáticos entre otros que interfieren en los subsecuentes análisis (Amsaleg et al, 2001; Schneegurt et al, 2003).
Po otro lado, se ha descrito que el pre tratamiento de las muestras de suelo con CaCO3, el cual es eficiente para la obtención de ADN (Cermak et al, 2008; Sagova et al, 2008; Wang et al, 2008). Por otro lado, el PVPP puede remover los ácidos húmicos, aunque se ha descrito una pérdida de material genético en la extracción. Este es ineficaz durante la lisis ce- lular, pero es útil en columnas de purificación del material genético para eliminar compuestos fenólicos u otras sustancias orgánicas (Steffan et al, 1988; Robe et al 2003; Cáceres et al, 2012; Singh et al, 2013), en el pre- sente trabajo se observó que el rendimiento del material genético de las muestras pre tratadas es similar al kit comercial (figura 1).
Código de la muestra | Tipo de suelo | Protocolo de extrac- ción | Pre- trata- miento | IP (A260- /230) | IP (A26- 0/280) | Rendi- miento μg/g [peso seco] 0.5 g de suelo) | Número de bandas |
S1 | Franco | Extr-acción de lisis directa modif-icada | Sin pre- tra- tamiento (SP) | 0,34±0,15 | 1,31±0,60 | 9,5±3,6 | 3 |
S2 | Arenoso | 0,39±0,29 | 2,3±0,49 | 27,5 ± 7,73 | 1 | ||
S3 | Arcilloso | 0,22±0,70 | 2,16±2,56 | 8,83 ± 5,83 | 2 | ||
C1 | Franco | CaCO3 (Ca) | 0,16±0,18 | 1,23±0,60 | 12,75 ± 11,15 | 10 | |
C2 | Arenoso | 0,17±0,03 | 1,26±0,23 | 6,5±8,23 | 6 | ||
C3 | Arcilloso | 0,26±0,28 | 1,28±0,90 | 15±11,15 | 5 | ||
P1 | Franco | PVPP (PV) | 0,31±0,19 | 1,42±0,76 | 10,91 ± 5,06 | 1 | |
P2 | Arenoso | 0,29±0,11 | 1,49±0,90 | 11,5±5,71 | 8 | ||
P3 | Arcilloso | 0,13±0,11 | 0,87±0,52 | 4,16±2,73 | 3 | ||
K1 | Franco | Kit Favorgen | Sin pre- trata- miento | 0,425 ± 0.14 | 1,30±0.27 | 10,5±2,82 | 1 |
K2 | Arenoso | 0,33±0,20 | 0,6±0,17 | 12,5±4,56 | 1 | ||
K3 | Arcilloso | 0,75±0,34 | 0,54±0,2 | 8,5±3,16 | 1 |
Fuente: Elaboracion Propia
Los diferentes extracciones y pre tratamientos aplicados en las diferen- tes muestras se valoraron mediante la capacidad de disminuir los inhibido- res presentes, mediante la amplificación de un segmento de la región variable (V3) del gen 16S ADNr (Wang et al, 2008), en el presente trabajo se utilizó el mismo método de purificación, los extractos de ADN obtenidos presentaron alta cantidad de contaminación proteica y ácidos húmicos, que no afectaron a la PCR, asimismo se utilizó como coadyuvante BSA para mejorar la eficien- cia de la amplificación en todas las muestras, a 0,8 ug uL-1 incrementa la efi- ciencia de la PCR actuando como una proteína captadora de iones que pue- den ser inhibidores de la Taq polimerasa (La Montagne et al, 2002).
En la figura 1 se observa el fragmento amplifcado de la region V3 del gen 16S ADNr en geles de poliacrilamida con en gradiente desnaturalizante, de acuerdo al número de bandas, se puede verificar la diversidad microbiana presente (Agnellia et al, 2004), en los tres tipos de muestras de suelo utiliza-
dos en este estudio el mayor bandeaje obtenido se encuentran en muestras procedentes de suelo francos (figura 2b carriles 4 y 5), arenoso y arcilloso (fi- gura 2b carriles 10 y 11), las cuales corresponden aquellas muestras que fue- ron sometidas al pre tratamiento con CaCO3 y con PVPP respectivamente en contraste a la muestras sin pre tratamiento solamente presentaron una ban- da. Asi mismo, se observa que el uso de carbonato es mas eficiente cuando se utiliza muestras procedentes de suelos francos, no así en muestras arenosas y arcillosas (figura 2b carriles 6 y 7), las muestras tratadas con PVPP presenta- ron el mayor numero de bandas en muestras arenosas y arcillosas (figura 2b carriles 10 y 11), se debe utilizar el pre tratamiento cuando se realiza un mé- todo directo de extracción de material genético, además de considerar según el tipo de muestra el uso de CaCO3 y/o PVPP.
En las muestras que presentaron mayor numero de bandas se observaron bandas consenso, representaria la presencia de comunidades bacterianas fre- cuentes en las diferentes muestras analizadas, con respecto al análisis reali- zado con el kit comercial se observa solo una banda consenso (figura 1 a ca- rriles 1 al 3).
a) 1 2 3 b) 4 5 6 c) 7 8 9 d) 10 11 12
Fuente: Elaboración Propia
Asimismo, se determinó que no existen diferencias estadísticamente signi- ficativas entre el número de bandas y protocolo de extracción (Kluskal Wallis p value>0,05). No obstante, el procedimiento de extracción mediante el cual se identificó mayor número de bandas fue mediante el pre-tratamiento con CaCO3 y el protocolo que identifico menor número de bandas fue median- te el Kit Favorgen. La mediana del número de bandas es 6 mediante el pre- tratamiento con CaCO3, con un valor máximo de hasta 10 bandas mediante este protocolo, por otro lado, mediante el kit de extracción el valor de la me- diana fue de 1 (figura 2).
Fuente: Elaboración Propia
De acuerdo al análisis de clúster realizado se identificó la estructura de las comunidades bacterianas representada por la formación de tres clados o agrupamientos: clado I constituido por K1, K2 y K3, en el cual se identificó la misma comunidad bacteriana en los tres tipos de suelo, el clado II represen- tado por S1, P1 C1, C2 y C3, en el cual las comunidades bacterianas en S1 es- tán presentes en P1, C1, C2 y C3 y el clado III, conformado por P2, P3, S1 y S2, donde se observa que las comunidades bacterianas se agrupan en relación al pre tratamiento empleado. Los procedimientos de pre tratamiento de extrac- ción de ADN, son específicos para los distintos tipos de comunidades bacte- rianas y del tipo de suelo.
Como señala Escalante et al, 2004, es posible caracterizar la diversidad no cultivable presente en diferentes ambientes por medio del análisis del meta- genoma bacteriano. La información generada permitirá comprender la fun- ción de las comunidades bacterianas en los ciclos biogeoquímicos que man- tienen a la biosfera, y cómo la actividad humana local y global puede alterar la diversidad microbiana. El análisis de la diversidad genética y metabólica del metagenoma bacteriano de muestras de suelo permite extraer y explotar su diversidad metabólica, incluyendo la de aquellos microorganismos conside- rados cultivables, y de aquellos aún no descubiertos. Esta metodología per- mitirá identificar actividades bacterianas novedosas con aplicaciones biotec- nológicas potenciales.
Fuente: Elaboración Propia
La extracción de ADN mediante los procedimientos de lisis directa, purifi- cación con Sephadex G 100 y el kit Favorgen sin pre tratamiento de las mues- tras de suelos francos, arenosos y arcillosos, no fue óptima respecto al estu- dio de la diversidad y riqueza bacteriana. Sin embargo, la aplicación de un pre tratamiento consistente en la adición de CaCO3 en muestras de suelos fran- cos permitió la identificación de una mayor diversidad y riqueza bacteriana. Asimismo, la adición de PVPP a suelos arenosos y arcillosos también permitió obtener las características descritas anteriormente utilizando el método PCR- DGGE, lo cual indica que los procedimientos de pre tratamiento con CaCO3 y PVPP son específicos para la extracción de ciertas comunidades bacteria- nas y del tipo de suelo.
Los resultados de este estudio señalan que el protocolo de extracción con la inclusión de los pre tratamientos descritos, representa una metodolo- gía útil y accesible para los estudios ecológicos bacterianos de suelos francos, arenosos y arcillosos con la facilidad de obtener la estructura y diversidad de las comunidades bacterianas.
Este trabajo ha sido realizado gracias al apoyo académico del Dr. Rolando Sánchez Montaño, la financiación del proyecto “Análisis tóxico-genético del agua de afluentes que abastecen la planta de tratamiento de Achachicala pro- venientes de las lagunas Milluni Chico, Grande y Janko Kkota; su incidencia en la salud humana y la adaptación de la flora microbiana”.
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