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REVISTA CON-CIENCIA N°2/VOL. 4 (NOVIEMBRE 2016) Pag. 35-44 ISSN: 2310-0265
Presencia de micronúcleos en células exfoliadas de la mucosa oral en personas expuestas a agentes genotóxicos
Presence of micronuclei in exfoliated cells of the oral mucosa in people exposed to genotoxic agents
TABORGA MANRIQUE, XIMENA1 QUISPE ARUHUITO, RICHARD1 LARREA POMA, MONICA M.1
FARFÁN OCHOA, PATRICIA1 REVOLLO ZEPITA, SUSANA1
FECHA DE RECEPCIÓN: 17/09/2016 FECHA DE ACEPTACIÓN: 4/10/2016
Micronuclei are used like biomarkers in order to determinate damage in the ADN. This damage is caused by genotoxic agents and they can be the origin of mutations or cancer. In order to determinate genotoxic risk due to work and harmful habits (tobacco and alcohol), 60 samples were analyzed. Cells of the oral mucosa were collected, dyed and their micronuclei were counted using a mi- croscope. People who participated as volun- teers in this study are men and women cov- ered in a range from 21 to 68 years, who work in tanneries, laboratories, oncology, radiology, in printing houses or who have harmful habits. In all groups micronuclei were found, howev- er, people who have unhealthy habits and are exposed to some other risk factors were those who had higher number of affected cells. On the other hand, a higher percentage of micro- nuclei in women and elder people was found.
1 Laboratorio de Genética Molecular, Instituto SELADIS, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas
Therefore it is concluded that all work activi- ties mentioned and harmful habits represent a risk to the genome integrity.
Micronúcleos, genotoxicidad
KEY WORDS
Micronucleus, genotoxicity
La división celular tiene como objetivo formar dos células hijas idénticas a la original; sin embargo algunos factores tales como sustancias genotóxicas, errores en la replicación, roturas cromosómicas, radiación y otros, pueden provocar pérdida del material genético, de modo que la célula tendrá una pe- queña masa nuclear separada del núcleo, es decir, un micronúcleo. Estos ge- notóxicos son básicamente de dos tipos, los que tienen efecto clastrogénico, es decir, los que producen roturas en los cromosomas, originando fragmen- tos sin centrómero y los que tienen efecto aneuploidógeno que correspon- den a cromosomas enteros que no se han podido unir al uso mitótico duran- te la división celular por alteraciones en el cinetocoro y han quedado fuera de los núcleos de las células hijas, o por interferencia en la formación del uso mitótico. Los micronúcleos resultantes se localizan en el citoplasma y tienen las mismas características tintoriales que el núcleo porque están formadas por cromatina sin una membrana propia (Torrez-Bugarín, Ramos-Ibarra 2013; Flores, Yamaguchi 2009).
La técnica de micronúcleos se utiliza con diversos fines, entre ellos para la determinación del daño genotóxico precoz, especialmente en salud ocu- pacional cuando se quiere establecer si los agentes a los que están expuestos los trabajadores están afectando al ADN; por otro lado también se la utiliza en estudios de monitoreo pues se ha demostrado que la expresión de los mi- cronúcleos está en directa relación con la exposición a genotóxicos, cuando la exposición cesa, disminuyen y desaparecen los micronúcleos (Flores y Ya- maguchi 2009; Torrez-Bugarín, et al 2013).
La identificación de micronúcleos puede ser realizada en células de des- camación de la mucosa oral, en linfocitos cultivados en el laboratorio, en eri- troblastos o en cualquier tipo de célula que se divida. El estudio de las célu- las de la mucosa oral tiene varias ventajas, entre ellas, que la toma de muestra no es invasiva, que permite conocer el efecto genotóxico de cualquier tipo de agente, inhalado o ingerido durante las últimas tres semanas (las células se dividen con cierta frecuencia lo cual refleja el efecto agresivo de cualquier tóxico), además, debido a que el 60% de la mucosa oral corresponde a epi- telio no queratinizado se puede teñir fácilmente en el laboratorio facilitan- do la observación de los componentes estructurales celulares. A través de este estudio se puede determinar el efecto genotóxico producido por el uso
de agentes químicos y radiactivos, por ejemplo, en salud ocupacional; hábi- tos deletéreos para la salud como los hábitos tabáquico y alcohólico; efectos de estados fisiológicos como vejez y malnutrición, etc. (Torres-Bugarín y Ra- mos-Ibarra 2013).
El presente trabajo forma parte del proyecto “Implementación de prue- bas moleculares para el diagnóstico precoz de cáncer de colon”. La determi- nación de daño del ADN por agentes genotóxicos a través de la técnica de micronúcleos fue agregada al proyecto como respuesta a la necesidad de los participantes de contar con la información que les permita saber si por su tipo de trabajo y/o hábitos de vida, están expuestos a desarrollar enferme- dades como el cáncer; por lo tanto, el propósito del presente estudio ha sido verificar el efecto dañino sobre el ADN de sustancias que tienen que ver con la actividad laboral y hábitos de vida.
Se incluyeron en este estudio a 60 voluntarios expuestos, por su trabajo o hábitos, a diferentes tipos de sustancias químicas: 40 trabajan en curtiembres, 5 en laboratorios, 3 en radiología, 4 en oncología, 1 en imprenta, 1 es artesa- no, 1 arregla impresoras y 5 no están expuestos laboralmente a genotóxicos pero tienen hábitos tabáquico, alcohólico o ambos. Del total de voluntarios, 22 eran mujeres y 38 varones, con edades comprendidas entre 21 y 68 años.
Transversal correlacional analítico
Se incluyeron a todas aquellas personas que, por su trabajo o sus hábi- tos, están expuestas a genotóxicos y accedieron o solicitaron participar en este estudio.
Ninguno
El proyecto que enmarca el presente trabajo está avalado por el Comité de Ética de la UMSA, por lo tanto, antes de la toma de muestra, se informó a los voluntarios, sobre los alcances del proyecto en forma verbal y escrita y se solicitó que firmaran un consentimiento informado, además se llenó una encuesta con los datos generales de los voluntarios, exposición a sustancias
químicas o radioactivas y los hábitos que predisponen al deterioro del mate- rial genético. Finalmente se recolectó muestras de descamación de la muco- sa oral, en portaobjetos, con ayuda de un bajalenguas.
Las muestras colectadas y fijadas en portaobjetos fueron teñidas con Giemsa. La observación de las células en el microscopio se realizó con el ob- jetivo de 40X. Se observaron 1000 células por persona.
Para la identificación de micronúcleos se consideró los criterios plantea- dos por “The International Collaborative Project on Micronucleus Frequency in Human Populations” (HUMN PROJECT), es decir: diámetro entre 1/16 a 1/3 del núcleo, forma redonda u ovalada, no refractarios y que se puedan distin- guir fácilmente de otros artefactos, que tengan la misma intensidad de tinción que el núcleo (ocasionalmente un poco más intensa), que tengan la misma textura, que se presente en el mismo plano focal que el núcleo, que las célu- las no estén solapadas y que la membrana celular y el citoplasma se encuen- tren íntegros (Tolbert 1991; Torrez-Bugarín, et al 2013; Fenech, et al 2003).
Para el análisis de los resultados se utilizó estadísticos básicos.
Se encontró micronúcleos en el 82% de las personas estudiadas (Gráfico 1), 91% en mujeres y 76% en varones, cabe aclarar que el número de varones era casi el doble que el de mujeres. En algunos países como Cuba se ha de- terminado que la incidencia en el género femenino supera al masculino entre los 25 y 50 años (edad reproductiva). Después de los 50 años la incidencia en los varones es mayor (García 1998).
Gráfico 1: Número de micronúcleos (MN) en relación al género
Se encontró mayor cantidad de micronúcleos en el género masculino como puede verse en el gráfico 2, en el que la media en este género es de 3,4 frente a 3 en el femenino. De acuerdo a este gráfico, una persona de sexo masculino tiene más tendencia a producir mayor cantidad de micronúcleos, lo cual, pro- bablemente se debe a una mayor exposición a agentes mutágenos.
Gráfico 2: Número de micronúcleos por persona según género
De las 1000 células observadas por cada paciente, se encontró entre 1 y 22 células con micronúcleos, el número de células que contenían micronúcleos aparece en la Tabla 1. Llaman la atención las dos cifras más altas, la de 22 mi- cronúcleos que corresponde a una persona no expuesta laboralmente a fac- tores de riesgo, pero que fuma y bebe con mucha frecuencia y tiene además familiares con cáncer y una persona mayor, que trabaja en radiología, en la que se encontraron 10 células con micronúcleos además de otras anormali- dades nucleares.
Tabla 1: Nº de micronúcleos por persona
Nº de MN/1000 células | Nº de voluntarios |
1 | 15 |
2 | 8 |
3 | 3 |
4 | 6 |
5 | 5 |
6 | 3 |
7 | 3 |
8 | 3 |
9 | 1 |
10 | 1 |
22 | 1 |
Se encontró algunas células con tres micronúcleos (fotos 1 y 2), otras con 2 (fotos 3, 4 y 5) y en la mayoría se encontró sólo un micronúcleo por célula (fotos 6 y 7). Se hallaron variaciones en las características morfológicas de los micronúcleos especialmente en el tamaño, por ejemplo, en la foto 1 se ob- serva 3 micronúcleos de diferente tamaño. También se encontraron diferen- cias en la textura, borde y la tonalidad tintorial de los micronúcleos en rela- ción al núcleo.
1
2
Fotos 1 y 2: Células con 3 micronúcleos
3
4
5
Fotos 3, 4 y 5: Células con 2 micronúcleos
6
7
Fotos 6 y 7: Fotos de células con 1 micronúcleo
Es bien conocido el hecho de que mientras mayor sea la persona exis- te más posibilidad de desarrollar enfermedades neoplásicas por la acumula- ción de mutaciones en el genoma (De Pinho 2000). De igual modo es más fá- cil dañar el ADN produciendo micronúcleos en personas de mayor edad. En el Gráfico 3 se hace una relación del porcentaje de micronúcleos hallado con la edad de las personas que fueron voluntarias, mostrando un mayor porcen- taje de micronúcleos en personas mayores.
Gráfico 3: Porcentaje de personas con micronúcleos según edad
Se encontró mayor cantidad de micronúcleos en el grupo de personas mayores a 50 años (gráfico 4), con una media de 4,3 micronúcleos por perso- na y una desviación estándar de 3,9. Las desviaciones estándar en los otros grupos fueron: de 21 a 30: 2,9; de 31 a 40: 5,2 y de 41 a 50: 2,2.
Gráfico 4: Promedio del número de micronúcleos según grupo etáreo
La mayoría de los voluntarios trabaja en curtiembres y casi todos, excep- to 5 están expuestos a agentes genotóxicos por la actividad laboral que rea- lizan. En todos los grupos, incluyendo a los que no están expuestos, se en- contraron células con micronúcleos, sin embargo estos grupos no pueden ser comparados porque no se cuenta con números equivalentes de personas en cada grupo.
El tratamiento del cuero en las curtiembres requiere el uso de una gran gama de sustancias químicas, entre ellas algunas cancerígenas reconocidas como el cromo y los compuestos aromáticos y fenólicos que por oxidación en el organismo llegan a integrarse al ADN alterando la replicación, transcrip- ción y traducción. El contacto o la inhalación de estas sustancias representa un riesgo grande para los trabajadores y cuando las aguas residuales de las cur- tiembres no son tratadas y no se hace un control riguroso de los desechos, las personas que viven en los alrededores también están en riesgo (Esparza 2013).
Muchos químicos usados en laboratorios y en curtiembres afectan el ciclo celular, su efecto está en relación con el grado de exposición, tiempo de ex- posición y tipo de agente químico, entre otros. Ejemplos del efecto de estos agentes son: 1) la formación de células binucleadas, picnóticas y con croma- tina condensada que se encontró en expuestos a nafta y 2) las células binu- cleadas y cariolíticas producidas por la exposición a tolueno, metanol, xileno y cloroetileno (Dominguez 2006).
La radiación ionizante también representa un factor de riesgo importante para el desarrollo de cáncer y leucemias, incluso la radiación ultravioleta pro- cedente del sol se ha vinculado con el desarrollo de cáncer de piel. Enton- ces no es de extrañar que 2 de las 3 personas que trabajan en radiología que fueron analizadas presentaran micronúcleos. La ausencia de micronúcleos en una de estas personas probablemente pueda explicarse por el hecho de que es joven y que no ha estado expuesta por mucho tiempo a la radiación que provoca su trabajo.
En las 4 personas que trabajan en oncología, no asociadas con el consumo de alcohol ni con el hábito de fumar, se encontró micronúcleos (3 de estas personas están en contacto con medicamentos citostáticos). Un resultado si- milar a este fue reportado por Dominguez (2006) quien, además de encontrar un número elevado de micronúcleos, reportó también cariólisis y cromatina condensada. Los citostáticos son drogas empleadas por su propiedad de fre- nar la proliferación celular incontrolada en pacientes con cáncer; sin embar- go la exposición frecuente puede causar mutaciones, inmunotoxicidad y cán- cer a los profesionales responsables de aplicar el tratamiento (Patiño 2003).
En relación a la frecuencia de micronúcleos en personas con hábitos noci- vos, de 10 que fuman habitualmente, se encontró que 9 (90%) tenían micro- núcleos, la persona restante estaba adquiriendo recién este hábito. Por otro lado, 22 personas tienen la costumbre de consumir bebidas alcohólicas, en- tre ellas 17 (77%) presentaban micronúcleos. También se consideró a 8 per- sonas que pensaban que habían abusado del consumo de alcohol, entre ellas 6 (75%) tenían micronúcleos.
El alto número de personas que fuman y presentan micronúcleos se expli- ca fácilmente cuando se considera que el tabaco tiene más de 4000 compues- tos químicos, 97% con actividad cancerígena, entre ellos los más activos son
los benzopirenos y dibenzoantracenos que activan componentes neutros de la fase particulada, estos son por si mismos tóxicos, pero además sus metabo- litos tienen la capacidad de unirse covalentemente al material genético for- mando aductos (Zalacain, et al 2005). Por otro lado, uno de los mecanismos que utiliza el organismo para defenderse es a través de sistemas enzimáticos que han sido clasificados como enzimas de fase I y enzimas de fase II; la acti- vidad de las enzimas de fase I da lugar a metabolitos intermediarios de natu- raleza electrofílica que atacan fácilmente a moléculas nucleofílicas como áci- dos nucleicos y proteínas (Zalacain, et al 2005).
Según la Organización Mundial de la Salud, el 22% de las muertes por cualquier tipo de cáncer está relacionado con el hábito tabáquico, y el 70% de las muertes por cáncer de pulmón (WHO 2015). Uno de los anteceden- tes nacionales en relación al hallazgo de micronúcleos en fumadores es el re- portado por Ayarde el año 2008, quien, además del tabaco, atribuyó mayor posibilidad de producir micronúcleos cuando la persona vive a mayor altura (Ayarde et al 2008).
Por otro lado, no hay una base científica que establezca que el alcohol por sí mismo tiene actividad genotóxica y, por tanto, predisponga al desarrollo de cáncer; sin embargo se sabe que aumenta la permeabilidad celular al alterar la morfología y disolver los lípidos, esta actividad facilita el ingreso de otras sustancias químicas que tienen actividad genotóxica. Además, el primer pro- ducto metabólico del alcohol es el acetaldehído que es capaz de producir mutaciones puntuales e interferir con la síntesis y reparación del ADN al inhi- bir la O metilguaniltransferasa que repara normalmente daños causados por agentes alquilantes (Seitz 2001, Figuero 2004).
Aunque no es tema de estudio del presente artículo, llamó fuertemente la atención la alta frecuencia de células con núcleo en cariorrexis (desinte- gración nuclear) y otras anormalidades nucleares de una persona mayor cuya ocupación es la radiología (fotos 8-10)
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Fotos 8: Cariorrexis, 9: núcleo lobulado y 10: núcleo de bordes irregulares.
Todas las actividades laborales exploradas además de los hábitos deleté- reos (tabaquismo y alcoholismo) se constituyen en factores de riesgo para la aparición de micronúcleos en las células.
La identificación de micronúcleos es sencilla y útil para el biomonitoreo del efecto genotóxico producido por agentes ambientales.
La presencia de micronúcleos en células exfoliadas de la cavidad oral es una señal de alerta que indica que los factores medioambientales, hábitos o la interacción de ambos está incidiendo sobre la integridad del genoma y por tanto es una señal de alerta para evitar el desarrollo de neoplasias.
