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REVISTA CON-CIENCIA N°2/VOL. 4 (NOVIEMBRE 2016) Pag. 21-33 ISSN: 2310-0265
Evaluación de la actividad de Baccharis latifolia
en modelos de artritis experimental
Evaluation of Baccharis latifolia activity in experimental arthritis models
CORRESPONDENCIA: EDUARDO.GONZALEZ@GMAIL.COM
FECHA DE RECEPCIÓN: 19/09/2016 FECHA DE ACEPTACIÓN: 4/11/2016
Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic au- toimmune and inflammatory disease leading to pannus formation followed by the destruc- tion of the joints; it is characterized by synovi- al hyperplasia, inflammation and angiogenesis. The plant species Baccharis latifolia is tradi- tionally used in many regions of our coun- try to treat pain, inflammation and arthritis. In the present study the anti-arthritic activity of ethanol extract of B. latifolia was evaluated in murine experimental model of rheumatoid arthritis induced by adjuvant, edema estima- tion / thickness of the inflamed foot, hemato- logical parameters (hemoglobin, erythrocyte sedimentation rate, erythrocyte count was as- sessed, total white blood cell) and radiological observation were evaluated. The oral admin-
Area de Farmacología, Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas “Luis Enrique Terrazas Siles”. Universidad Mayor de San An- drés, Av. Saavedra 2224. La Paz, Bolivia.
Carrera de Química Farmacéutica, Fac. Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés, Av. Saavedra 2224. La Paz, Bolivia.
Instituto de Investigaciones Químicas, Facultad de Ciencias Puras y Naturales, Universidad Mayor de San Andrés, Calle 27 Cota Cota Campus Universitario. La Paz, Bolivia.
* Autor Correspondencia
istration of the ethanolic extract of B. latifo- lia (600 mg / kg p.c.) significantly inhibited (p
<0,001) increased edema / paw thickness in the subchronic model of arthritis. Similarly, B. latifolia (500 mg / kg bw) significantly inhibited the increase of edema / paw thickness in the model of chronic arthritis (p <0.05, p <0.01), the weights of the animals were kept without variation during treatment. Moreover hema- tological parameters indicate that hemoglo- bin levels decrease in arthritic mice and that this decline is reversed after administration of the extracts of B. latifolia, this same profile is observed recovery after red blood cell count. Additionally, erythrocyte sedimentation rate (ESR) increased in arthritic mice is reversed af- ter administration of B. latifolia. The radiolog- ical analysis showed the effect of ethanol ex- tract of B. latifolia in delaying bone destruction. The results suggest that the ethanolic extract of B. latifolia has potential antiarthritic activity.
Baccharis latifolia, Actividad antiartrítica, Adyuvante Completo de Freund
KEY WORDS
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria crónica, autoin- mune, caracterizada por manifestaciones en las articulaciones (dolor, tumefac- ción y rigidez) y la presencia de síntomas generales (cansancio, sensación de malestar, fiebre ligera, inapetencia y pérdida de peso corporal), afecta aproxi- madamente al 1% de la población mundial (Deng y col., 2006). La AR es mu- cho más frecuente en mujeres que en hombres y en general aparece en per- sonas adultas mayores, aunque puede iniciarse en cualquier etapa de la vida, con independencia de la etnia, el sexo y los hábitos de vida. Esta enfermedad se inicia con la inflamación de la membrana sinovial, que con frecuencia lleva a la destrucción erosiva del cartílago adyacente y el hueso, lo que provoca la incapacidad física moderada del 80% de los pacientes y una muerte temprana.
En la actualidad no existe cura para la AR, ni medicamentos que puedan revertir las deformaciones articulares. La terapia empleada consiste funda-
mentalmente en el empleo de analgésicos, medicamentos antiinflamatorios, inmunosupresores y estimulantes, que controlan la sintomatología y enlen- tecen el curso de la enfermedad, sin embargo los enfermos requieren trata- miento farmacológico de por vida e inevitablemente se tropieza con efectos adversos que limitan la consecución del tratamiento, como es el caso de los efectos secundarios producidos a nivel gastrointestinal por los antiinflamato- rios no esteroideos (AINEs), grupo de fármacos frecuentemente empleados en esta patología. Por esta razón entre un 30 a 60 % de los pacientes con AR recurren a la medicina complementaria, buscando fuentes adicionales de ali- vio y/o menores efectos secundarios (Nagore y col., 2015).
En el presente estudio se evaluó la actividad antiartrítica del extracto eta- nólico de B. latifolia en modelos sub-crónico y crónico de artritis reumatoi- de inducida por Adyuvante Completo de Freund (con y sin carragenina) en animales de experimentación, mediante la estimación del edema/espesor en milímetros de la pata inflamada, parámetros hematológicos (hemoglobina, velocidad de sedimentación globular, recuento de eritrocitos, recuento total de leucocitos) y observación radiológica.
Las hojas de la especie vegetal Baccharis latifolia (Asteraceae) fueron co- lectadas en octubre de 2014 en la zona de Apaña (3.800 m.s.n.m) localiza- da en las afueras de la ciudad de La Paz, Bolivia. La identificación botánica se realizó por la Lic. Esther Valenzuela experta del Jardín Botánico del Herbario Nacional de Bolivia LPB, donde se puede encontrar un ejemplar de la misma.
El extracto etanólico fue obtenido en el Laboratorio de Bioorgánica del Ins- tituto de Investigaciones Químicas de la UMSA. Las partes aéreas de la especie
en estudio fueron secadas y molidas dando un total de 864 g. Este material ve- getal fue sometido a una extracción por maceración, a temperatura ambiente, con EtOH de 96º durante 15 minutos, obteniendo un extracto que fue concen- trado por rotaevaporación hasta eliminación completa del solvente, dando 102 g de extracto crudo, con un rendimiento del 11,8 % respecto a la planta seca.
El estudio se realizó con ratones machos Swiss con un peso de (22±5g) ob- tenidos del Bioterio de la Facultad de Cs. Farmacéuticas y Bioquímicas UMSA y del Bioterio de Instituto Nacional de Laboratorios de Salud (INLASA). Todos los animales fueron mantenidos en cajas de polipropileno en una habitación con temperatura controlada a 23±1ºC con un ciclo de 12 horas luz/12 horas oscuridad. Los animales fueron alimentados ad libitum con una dieta normal y aclimatados durante una semana antes de comenzar el experimento.
Para inducir la artritis sub-crónica se administró por vía intradérmica, en la porción inferior de la base de la cola, a todos los grupos 0,1 ml de Adjuvante Completo de Freund (ACF), y se dejó a los animales en observación por seis días. Posterior a este tiempo, se midió el espesor plantar inicial de todos los animales y luego al grupo control artrítico se administró 0,1 ml/10g de agua, al segundo grupo se administró por vía oral indometacina a una dosis de 3mg/kg de peso corporal, al tercer grupo se administró por vía oral el extrac- to etanólico de B. latifolia en una dosis de 600 mg/kg; después de transcurrida una hora se administró 0,1 ml de carragenina (3% p/v en solución salina) en la aponeurosis subplantar a todos los grupos, posterior a esta administración, se midió el espesor de la pata de todos los grupos a las 0h, 3h, 5h, 24h, 48h, 72h, 96h con un Vernier digital. (Choudhary y col., 2014; Liu y col., 2009). El extrac- to, la indometacina y el vehículo se administraron diariamente durante 5 días, para evaluar la actividad antiartrítica subcrónica.
Evaluación del peso y espesor de la pata
Los animales fueron divididos en cinco grupos de diez animales cada uno, a cada grupo se le hizo el seguimiento de peso durante todo el desarrollo de la experimentación. La artritis crónica fue inducida por la inyección de 0.01 ml de Adyuvante Completo de Freund (10 mg de Mycobacterium tuberculo- sis muertas por calor en 1 ml de aceite de parafina) en la pata derecha de los animales vía intradérmica, excepto a los animales del grupo control normal. Después de 21 días de la inyección con ACF, los tratamientos fueron admi- nistrados vía oral a los diferentes grupos por 21 días más. Los grupos forma-
dos fueron: grupo I ratones normales tratados con agua (Control); grupo II: ratones artríticos tratados con indometacina (2 mg/Kg/día); grupo III: ratones artríticos tratados con extracto de B. latifolia (500 mg/Kg/día); grupo IV: ra- tones artríticos tratados solo con agua (control artrítico). El extracto y la indo- metacina fueron disueltos en vehículo (0,5% de carboxi metil celulosa, 0,9% de cloruro de sodio y 97,2% de agua). El edema/espesor de la pata se medió con un Vernier digital antes de la inducción, antes del tratamiento, después del tratamiento por un periodo total de 6 semanas (Koch y col., 1998; New- bould, 1965).
Se realizó a través de la observación macroscópica de la hinchazón/for- mación del edema en la pata de los animales de experimentación y se evaluó mediante la siguiente escala de puntos: 0 = ninguna formación o hinchazón/ edema; 1 = muy leve; 2 = leve; 3 = moderada; 4 = grave, el día 21 y el día 42 antes y después del tratamiento.
Al finalizar el experimento se recogió la sangre con y sin heparina para so- meterla a separación del suero y realizar la estimación de parámetros hema- tológicos tales como hemoglobina, glóbulos blancos (WBC), glóbulos rojos (RBC) y velocidad de sedimentación (VSG). (Tietz, 2006).
Las radiografías fueron tomadas en el Servicio de Radiología e Imageno- logía de la Facultad de Odontología de la Universidad Mayor de San Andrés, mediante un equipo radiográfico (Focus 70 Kvp), bajo la coordinación de los doctores Mirian Quiroga Ch., Neil Gonzales y Richard Ramos.
Los resultados se presentan como media ± SEM. La diferencia estadística entre los grupos se realizó mediante análisis de una vía de la varianza (ANO- VA). La diferencia en los valores de p<0,05; 0,01; 0,001 fueron considerados significativos. Los datos fueron analizados utilizando Graph Pad Instat Soft- ware (CA, EE.UU.).
Evaluación de la actividad antiartrítica inducida por Adyuvante Completo de Freund y carragenina en la pata (A-ACF+C)
En la figura 1 se muestran los resultados de la actividad antiartrítica del extracto etanolico de B. latifolia a una dosis de 600 mg/kg de peso corpo-
ral a través de la medición del edema/espesor de las patas de los anima- les de experimentación durante 96 horas de tratamiento. La actividad antiar- trítica subcrónica frente al control artrítico fue significativa (p<0.05, p<0.01, p<0.001) en todas los tiempos evaluados (0, 1, 3, 5, 24, 48, 72 y 96 horas). El patrón indometacina mostro también una disminución significativa frente al grupo control, siendo esta actividad de manera general mayor comparada frente al grupo del extracto.
El edema de pata inducido por carragenina produce una respuesta en tres fases en función del tiempo y esta se correlaciona con la respuesta inflama- toria en el hombre. El incremento del edema/espesor de la pata en la prime- ra hora después de la administración de la carragenina se relaciona con el au- mento en la permeabilidad vascular inducida por la histamina, seguida de la acción de la serotonina y cininas durante la segunda y tercera hora, el ede- ma a las cuatro y seis horas se relaciona con la liberación de prostaglandinas y leucotrienos (Nair y col., 2012). Los resultados muestran un mayor efecto de la indometacina a partir de las 4 horas después de su administración debido a su actividad principal sobre la síntesis de prostaglandinas. El extracto etanóli- co de B. latifolia produjo una reducción significativa de la inflamación frente al control artrítico a una dosis de 600 mg/kg desde la primera hora después de su administración, lo que sugiere que este extracto podría presentar acti- vidad frente a diferentes mediadores de la inflamación. Por otro lado el ede- ma/espesor de la pata medida a las 48, 72 y 96 horas después de la inyección de la carragenina se relaciona principalmente a la actividad mediada por los macrófagos; observándose en el grupo control artrítico una marcada diferen- cia de edema/espesor de la pata comparada con la fase inicial.
Evaluación de la actividad antiartrítica inducida por Adyuvante Completo de Freund (A-ACF): Evaluación del peso, edema de la pata y valoración ma- croscópica de la artritis
En la figura 2 se muestran los resultados de la evaluación del extracto de
En las tres primeras semanas de inducción de la artritis los pesos no au- mentaron de manera significativa para todos los grupos, desde la cuarta se- mana se observa un aumento significativo en todos los grupos respecto del peso de las tres primeras semanas antes del tratamiento. En el grupo control artrítico, el grupo tratado con indometacina y el grupo tratado con B. latifolia los pesos se mantuvieron constantes durante las tres semanas de tratamien- to y no hubo diferencias estadísticamente significativas entre ellos. Lo que se esperaría es que los pesos de los animales evaluados aumenten gradualmen- te según van creciendo y aumentan de tamaño, pero durante el transcurso de la enfermedad los pesos disminuyen, posiblemente debido a la falta de apeti- to correlacionada por el dolor y la inflamación que imposibilita el movimien- to de los animales de manera normal, sin embargo con la administración de la indometacina y el extracto de B. latifolia se observa una tendencia a man- tener sin variación el peso en todos los grupos.
El extracto de B. latifolia presento diferencia significativa frente al control artrítico a partir de la primera semana de su administración al igual que la in- dometacina que presento un mayor efecto en la quinta y sexta semana. En la quinta y sexta semana hubo una disminución de la inflamación por el extracto de B. latifolia pero esta fue menor que en la cuarta de administración que se observó una disminución mayor del edema/espesor de las patas. En la quinta
y sexta semana hubo una significativa disminución de la inflamación con in- dometacina comparada con la primera y segunda semana de tratamiento (Fi- gura 3), el extracto etanólico de B. latifolia tiene un efecto antiartrítico signifi- cativo en la cuarta semana a la dosis de 500 mg/Kg de peso corporal.
La tasa de inhibición en la artritis (Figura 4) con una dosis diaria del extrac- to de B. latifolia de 500 mg/kg de peso corporal fue significativamente similar al control positivo indometacina en la puntuación macroscópica del edema/ espesor de las patas, observándose una disminución mayor en el edema/es- pesor en la última semana de tratamiento.
Los principios fitoquímicos presentes en B. latifolia son flavonoides y compuestos fenólicos simples, entre ellos la acacetina, luteonina, 7,4´-dime- toxikaempferol, 7.4´-dimetoxiapigenina, rhamnazina, 7,3´,4´trimetoxiquer- cetina 4´-metoxirhamnazina, 5,4´-dimetoxiapigenina, acacetina 4´metoxia- pigenina, 7-metoxiquercetina, 7,3´,4´-trimetoxiluteolina (Flores y col., 2011), también se reportó la presencia de ocho compuestos, un derivado prenilado de ácido cumarico, tres triterpenos tipo ent-labdano y cuatro sesquiterpenos (Zdero y col., 1989). Al estudiarse la composición del aceite esencial de B. lati- folia se encontró la presencia del limoneno que ha reportado reducir la infla- mación inducida por lipopolisacárido y tiene efecto en la producción de óxi- do nítrico, del γ-interferón, y de la IL-4 (Souza y col., 2003). Por otra parte los flavonoides luteolina y acacetina, presentes en B. latifolia presentan actividad antiinflamatoria en ratones inducidos con ACF (López y Lázaro 2009, Pinzo y col., 2011, Pan y col., 2006).
La artritis producida por adyuvante es un modelo experimental de poliar- tritis, que produce inflamación poliarticular, marcada resorción ósea y proli- feración perióstica. La inyección en la almohadilla plantar de la pata permite el estudio de la reacción inflamatoria aguda en esa área, así como la reac- ción inmunológica que se desarrolla aproximadamente en nueve días (Chang, 1980). El ACF induce una respuesta principalmente celular, estimula la res- puesta inmune innata y particularmente la presentación antigénica por las células dendríticas que han recibido señales de carbohidratos y glicolípidos de la mico bacteria a través de sus receptores tipo Toll (De Gregorio y col., 2009). Los macrófagos, células T y fibroblastos sinoviales son agentes impor- tantes en la AR, los macrófagos son células secretoras de mediadores de la inflamación, incluyendo proinflamatorias y citotoxicas. En los modelos de- nominados (A-ACF+C) y (A-ACF) se produce la liberación de diferentes me- diadores y una actividad mediada principalmente por macrófagos, probable- mente el extracto de B. latifolia interfiere en la activación de linfocitos T y/o macrófagos debido a la presencia de los flavonoides acacetina y luteolina.
Los parámetros hematológicos evaluados en animales de experimenta- ción fueron: la hemoglobina, recuento de glóbulos rojos (RGR), velocidad de eritrosedimentación (VES) y recuento de glóbulos blancos (RGB). Los cam- bios hematológicos asociados con la artritis se presentan en la tabla 1.
Tabla 1. Efecto de B. latifolia sobre los parámetros hematológicos en ratones de experimentación
GRUPOS | Hemoglobina | RGR | RGB | Velocidad de eritro- sedimentación |
60 min | ||||
Control negativo | 17,391 ± 0.2785 | 6.324 ± 0.1013 | 5.090 ± 0.6871 | 0.96 ± 0.02667 |
Control artrítico | 15,43 ± 0,36** | 5,61 ± 0,13** | 9,13 ± 1,52*** | 2.25 ± 0.16*** |
Indometacina | 17.380 ± 0.4569 | 6.320 ± 0.1661 | 4.444 ± 0.4424* | 0 ± 0 |
B. latifolia | 19.141 ±0.4585* | 6.924 ± 0.1816* | 6.920 ± 1.016* | 1 ± 0 |
Los resultados obtenidos fueron comparados con los valores hematológi- cos obtenidos en ratones sanos (control negativo), en ratones artríticos (rato- nes no tratados) y en ratones artríticos tratados con indometacina (fármaco control). Éstos resultados señalan que los niveles de hemoglobina disminu- yen en ratones artríticos y que esta disminución es revertida tras la adminis- tración de los extractos de B. latifolia. Éste mismo perfil de recuperación es observado tras el recuento de glóbulos rojos. Por otro lado, la VSG se incre- menta en ratones artríticos, este parámetro también es revertido tras la admi- nistración de B. latifolia, sin embargo el extracto no produce un cambio en la VSG que alcance los valores normales obtenidos en ratones sanos. En el caso del recuento de glóbulos blancos, se observa un incremento en el número de glóbulos blancos en ratones artríticos, pero tras la administración del extrac- to los glóbulos blancos se incrementan aún más, este fenómeno podría de- berse a algún tipo de reacción inmunológica producida por el extracto en los ratones.
Los cambios radiológicos fueron observados en los animales de experi- mentación antes y después del tratamiento en un equipo Focus de 70 Kvp. Las imágenes fueron leídas de forma independiente en puntuaciones de moda registradas de 0 a 5 de acuerdo con la destrucción de huesos y articu- laciones. (Delgado M, 2005).
Las imágenes radiológicas (Figura 5 A, B, C, D) muestran la pata artrítica inflamada, con deformación y desviación de las articulaciones a nivel de las falanges y el metacarpo comparadas frente al grupo control negativo, en la imagen de la pata del ratón tratado con indometacina se observa una reduc- ción en la inflamación y deformación de la articulación del metacarpo y falan- ges, con B. latifolia se observa una mejora en las articulaciones y una dismi- nución de la inflamación excepto a nivel de las terminaciones de las falanges, comparada con al grupo control artrítico.
D
C
B
A
En este estudio, el efecto del extracto etanólico de B. latifolia fue evalua- do en modelos de artritis experimental inducida por ACF, observándose que a una dosis diaria de 500 y 600 mg/kg , disminuyo significativamente el ede- ma/espesor de la pata de los animales artríticos; en las placas radiológicas se observa un retraso de la destrucción del hueso, y los resultados hematológi- cos fortalecen el efecto presentado por el extracto B. latifolia respecto de los resultados mostrados frente al grupo control artrítico y control negativo. Por lo tanto podemos concluir que el extracto etanólico de B. latifolia se consti- tuye en una especie potencial como tratamiento alternativo y/o coadyuvan- te de la artritis.
El presente trabajo se realizó gracias al financiamiento otorgado al proyec- to UMSA-IDH “Estudios de producción y mecanismos de acción de compo- nentes activos de Baccharis latifolia (chilca) para el desarrollo de un producto fitoterapéutico contra inflamaciones crónicas” desarrollado dentro del Con- venio de cooperación de los Institutos IIFB e IIQ de la Universidad Mayor de San Andrés a quienes va un especial reconocimiento. Un especial agradeci- miento a los doctores Mirian Quiroga Ch., Neil Gonzales y Richard Ramos de la Unidad de Radiología de la Facultad de Odontología de la UMSA por la co- laboración prestada a este estudio.
