4
REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 4 (2016) 49-60
Técnica Headspace asociada a cromatografía de gases para la identificación y cuantificación de ácidos grasos volátiles producidos tras la digestión anaeróbica
de paja de cebada Hordeum vulgare
GRADOS TORREZ, RICARDO ENRIQUE 1
ÁLVAREZ ALIAGA, MARÍA TERESA1
1 Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas ”Luis Enrique Terrazas Siles”. Universidad Mayor de San Andrés, Av. Saavedra 2224. La Paz, Bolivia.
FECHA DE RECEPCIÓN: 18/02/2016 FECHA DE ACEPTACIÓN 10/05/2016
Abstract
With the aim to obtain basic criteria to identification, quantification and monitor- ing of volatile fatty acids (VFAs) produced during anaerobic digestion of barley straw by microbial consortia TACANA, the Head- space technique was optimized. This tech- nique allows quantify individual VFAs when are first volatilized from the crude sample and then injected directly to a gas chro- matograph. The standard VFAs showed the following retention times: acetic acid 2,71 min, propionic acid 4,12 min, i-butyric acid 5,21 min, n-butyric acid 5,68 min, i-valeric acid 6,62 min and n-valeric acid 7,25 min. The standardization curves and line equa- tions allowed determining an increase in acetic acid concentration from 37,7 ± 1,58 to 72,2 ±1,85 mM and a decrease in n-bu- tyric acid concentration from 133 ± 2,54
to 62,1 ± 2,12 mM by increasing the barley straw concentration from 5 to 10 % w/v, re- spectively, after 30 days of anaerobic diges- tion. These parameters are very useful due biotechnological interest that VFAs have as feedstock to produce not only renewable energy sources like biogas and bioethanol, but also to eco-friendly compounds pro- duction like poly-hydroxyalkanoates.
Ácidos grasos volátiles (AGVs), Headspace, Cromatógrafo de gases, Digestión anaeróbica.
KEY WORDS
Volatile fatty acids (VFAs), Headspace, Gas chromatograph, Anaerobic digestion.
La digestión anaeróbica es un proceso biológico de degradación orgáni- ca bacteriana en ausencia de oxígeno, en el que se produce principalmente una mezcla de gases y un componente acuoso o sedimento formado por re- siduos digeridos y sin digerir (Quispe y col., 2005). La digestión anaeróbica por cultivos mixtos – denominados consorcios microbianos – es favorecida económicamente debido a que las condiciones de esterilización, manipuleo y mantención, son más sencillas que con un cultivo puro, además, los culti- vos mixtos están conformados por un gran número de diferentes microorga- nismos separados en familias metabólicas, de tal forma que el producto me- tabólico de una puede servir de sustrato para la otra, haciendo el proceso metabólico global mucho más eficiente (Sánchez y col., 1994). Durante la di- gestión anaeróbica, las moléculas complejas presentes en la materia orgánica (polisacáridos, celulosa, hemi-celulosa, lignina, xilano, etc) se descomponen para dar como productos finales metano y dióxido de carbono. El proceso consta de cuatro etapas: Hidrólisis, acidogénesis, acetogénesis y metanogé- nesis (Bouallagui y col., 2005, Adekunle and Okolie, 2015) (Figura 1).
La paja de cebada (Hordeum vulgare) es un residuo agrícola que consti- tuye un problema en las labores de explotación agrícola afectando al medio ambiente en todas las regiones del mundo (Quispe y col., 2005). Está forma- da por compuestos orgánicos complejos, insolubles y de alto peso molecu- lar (compuestos lignocelulósicos), como la lignina, celulosa y hemicelulosa (Wang y col., 1999). Su hidrólisis durante la digestión anaeróbica está catali- zada por enzimas bacterianas extracelulares que la transforman en produc- tos simples, solubles y de bajo peso molecular (Tabla 1). Éste paso es llevado a cabo principalmente por bacterias anaeróbicas estrictas como los bacteroi- des y clostridios, y algunas anaeróbicas facultativas como las del género Es- treptococci (Yadvika y col., 2004).
Los productos de la hidrólisis son fermentados por microorganismos aci- dogénicos presentes en el cultivo mixto generando hidrógeno, dióxido de carbono y ácidos grasos volátiles (AGVs). Los AGVs comprenden un amplio grupo de moléculas de ácido carboxílico de bajo peso molecular como el áci- do acético, propiónico, butírico, valérico y algunos amino ácidos (Jain y col., 1998; Ábalos y col., 2000). Bacterias acetogénicas como S. wolfei y S. wolini pueden retransformar los AGVs en ácido acético e hidrógeno como produc- tos principales (Yadvika y col., 2004). Por otro lado, bacterias metanogénicas como Methanosarcina spp y Methanotrix spp transforman el ácido acético en metano (Geeta y col., 1994).
En el Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas (IIFB) se han de- sarrollado modelos para la digestión anaeróbica de la papa (Solarum tubero- sum) (Quispe y col., 2004), de frutas y verduras (Crespo y col., 2005, Álvarez y col., 2005) y de varios residuos agrícolas (Álvarez y col., 2005, Chávez y col., 2006, Chambi y col., 2007 y Grados y col., 2008) utilizando cultivos mixtos presentes en lodos y aguas residuales. En estos estudios, los AGVs totales ob- tenidos tras la digestión anaeróbica fueron utilizados como sustratos para la obtención de etanol, sulfuro de hidrógeno, metano y poli-hidroxialcanoatos.
Varios métodos cromatográficos han sido descritos para la determinación de AGVs individuales (Angelidaki y col., 1990; Manni y Caron, 1995; Albert y Martens, 1997; Pan y col., 1995; Yo, 1999). Sin embargo la mayoría de éstos re- quieren la preparación de la muestra y extracción de los AGVs antes de ser inyectados al cromatógrafo. Algunos métodos incluyen la filtración y centri- fugación (Angelidaki y col., 1990), la extracción previa con un solvente (Manni and Caron, 1995) y la micro extracción en fase sólida directamente de la fase acuosa (Pan y col., 1995; Yo, 1999).
Los métodos que emplean la filtración, lidian en general con muestras complejas, sólidas o viscosas, esto conduce a la necesidad del mantenimien- to extensivo y continuo del sistema de filtración para obtener el flujo reque- rido (Boe y col., 2007). No obstante, se ha desarrollado una técnica directa de extracción de AGVs – técnica Headspace – basada en la volatilización de los mismos hacia el espacio superior existente entre la muestra (fase líquida) y la tapa del tubo (Boe, y col., 2007). Una vez volatilizados, los AGVs que compo- nen la muestra son retirados e inyectados directamente al cromatógrafo de gases (Chen y col., 1994; Ábalos y col., 2000; Ábalos y Bayona, 2000) (Figura 2). La técnica Headspace elimina la necesidad de utilizar solventes para la ex- tracción, es simple, rápida, sensible y permite el análisis de componentes vo- látiles – como los AGVs – a partir de soluciones o mezclas complejas sin la in- terferencia de otros compuestos no volátiles (Chen y col., 1994).
El objetivo de este estudio fue utilizar la técnica Headspace asociada al análisis por cromatografía de gases para identificar y cuantificar los AGVs in- dividuales producidos tras la digestión anaeróbica de paja de cebada (Hor- deum vulgare) por el consorcio microbiano TACANA.
Consorcio microbiano “TACANA”, recolectado de la comunidad de Santa Rosa de Maravilla, provincia Ixiamas, La Paz - Bolivia. Estudios anteriores con- firman que éste consorcio posee capacidad degradativa de material celulósi- co y xilanósico (Chambi y col., 2007).
El consorcio fue inoculado en medio Anaeróbico fluido (línea comercial Scharlaw Chemie S.A. Barcelona – Spain), en condiciones de cultivo estacio- narias (Batch) durante 7 días a 37 ºC.
En botellas de 100 mL de capacidad, se colocaron 4 u 8 g (5 y 10% p/v respectivamente) de paja de cebada. Se añadió 80 mL de medio basal 11 (NH4Cl 100 g/L, NaCl 10 g/L, MgCl2.6H2O 10 g/L, CaCl2.2H2O 5 g/L, K2HPO4.3H2O
200 g/L, FeCl3.4H2O 1,5 g/L, H3BO3 60 mg/L, HCl 25% v/v 6,5 mL, CoCl2.6H2O
200 mg/L, MnCl2.4H2O 100 mg/L, NaMoO4.2H2O 25 mg/L, ZnCl2 70 mg/L,
NiCl2.6H2O 25 mg/L, CuCl2.2H2O 15 mg/L, NaSeO3 3 mg/L, NaOH 0,5 g/L, NaHCO3 8,5 g/L). El medio fue saturado con N2, las botellas fueron selladas con anillos metálicos y autoclavadas. Cada botella fue inoculada con 5 mL de consorcio microbiano. Las botellas fueron cultivadas a 37 ºC por 30 días. La concentración de AGVs totales fue monitoreada durante todo el proceso.
Los AGVs totales fueron determinados por el método de titulación des- crito por Buchauer (1998). El cultivo microbiano fue centrifugado a 3500 rpm por 10 min y filtrado (20 μm). La muestra fue titulada con H2SO4 0.1 N desde un pH de 5 a 4. El volumen gastado es proporcional a la cantidad de AGVs to- tales. Las mediciones fueron realizadas por duplicado y los cálculos de acuer- do a la siguiente fórmula:
AGVs totales (mg/L) = (131340 x N x VAg/Vm) – 3.08 x (pHi – 25) Dónde:
N = Normalidad del ácido sulfúrico (mmol/L)
VAg = Volumen de ácido sulfúrico gastado (de pH 5 a 4)
Vm = Volumen de la muestra pHi = pH inicial de la muestra
La identificación y concentración de AGVs individuales fue realizado por cromatografía de gases a través del método Headspace (Ábalos y col. 2000, Boe y col., 2007, Ábalos y Bayona, 2000). Un volumen de 9 mL de muestra fue transferido y sellado en un vial de 10 mL de capacidad. La muestra fue incu- bada a 60 ºC por 24 h para asegurar que los AGVs pasen al estado gaseoso. Después de este periodo, 0.5 mL de la fase aérea fue inyectada en un croma- tógrafo de gases (Clarus 500 Perkin Elmer) acoplado a un detector de ioni- zación a llama. Los AGVs de la muestra fueron impulsados por hidrógeno a través de una columna ELITE-1 (30 m x 0.25 mm) para su separación. Según Ábalos y col (2000), la temperatura inicial del horno fue programada a 70 ºC por 3 min, luego incrementada a razón de 15 ºC/min hasta 200 ºC. La tempe- ratura final fue mantenida por 3 min. Las temperaturas del inyector y detec- tor fueron programadas a 260 ºC. Para identificar los AGVs individuales de la muestra, se determinaron los tiempos de retención empleando soluciones estándar de ácido acético, propiónico, iso-butírico, n-butírico, iso-valérico y n-valérico (Figura 4). El cálculo de la concentración de AGVs individuales en la muestra, fue realizado a través de curvas de calibración empleando dilucio- nes seriadas de ácido acético, propiónico, n-butírico y n-valérico (Figura 5), las determinaciones fueron realizadas por duplicado (Figuras 6 y 7).
La concentración de AGVs totales producidos tras 30 días de digestión anaeróbica de paja de cebada al 5 y 10% p/v por el consorcio TACANA, fue de
8.1 ± 0.236 g/L y 10.2 ± 0.199 g/L, respectivamente (Figura 3).
El cromatograma obtenido tras la separación de una mezcla de AGVs es- tándar extraídos a través del método Headspace (Ábalos y col. 2000) (Véa- se Materiales y métodos), señala los tiempos de retención del ácido acéti- co (2,71 min), ácido propiónico (4,12 min), ácido i-butírico (5,21 min), ácido n-butírico (5,68 min), ácido i-valérico (6,62 min) y ácido n-valérico (7,25 min) (Figura 4).
En la Figura 5 se observan las curvas de calibración de AGVs estándar, como del ácido acético (Figura 5A), propiónico (Figura 5B), n-butírico (Figura 5C) y n-valérico (Figura 5D).
El análisis de las muestras correspondientes a los sobrenadantes obtenidos tras 30 días de digestión anaeróbica de paja de cebada al 5 y 10% p/v por el
consorcio TACANA, indica la presencia de tres AGVs: ácido acético (2,71 min), ácido propiónico (4,12 min) y ácido n-butírico (5,68 min), identificados según sus tiempos de retención (min) (Figuras 6 y 7).
Por otro lado, las áreas de los picos (μV s) correspondientes a los tres AGVs identificados en las muestras, fueron interpolados utilizando las ecuaciones de la rectas provenientes de las curvas de calibración (Figura 5). Los resulta- dos indican la producción de 37,7 ± 1,58 mM de ácido acético, 1,09 ± 0,023 mM de ácido propiónico y 133 ± 2,54 mM de ácido n-butírico tras la diges- tión anaeróbica de paja de cebada al 5% p/v (Figura 6), y 72,2 ± 1,85 mM de ácido acético, 0,98 ± 0,18 mM de ácido propiónico y 62,1 ± 2,12 mM de ácido n-butírico con paja de cebada al 10% p/v (Figura 7).
Figura 1. Etapas clave del proceso de la digestión anaeróbica: hidrólisis, acidogénesis, acetogénesis y metanogénesis (Extraído de Adekunle and Okolie, 2015).
Figura 2. Representación esquemática del sistema de extracción Headspace
(Extraído de Queiroz y col., 2001)
Figura 3. Cuantificación de AGVs totales (método de titulación: Buchauer, 1998) producidos durante la digestión anaeróbica de paja de cebada al 5 y 10% p/v respectivamente, por el consorcio TACANA.
Figura 4. Determinación de los tiempos de retención de AGVs estándar a través del sistema de extracción Headspace asociado a cromatografía de gases.
Figura 5. Curvas de calibración de AGVs estándar. A. Ácido acético (R2=0.9937).
B. Ácido propiónico (R2=0.9941). C. Ácido n-butírico (R2=0.9916).
D. Ácido n-valérico (R2=0.96).
Figura 6. Identificación y cuantificación de AGVs individuales producidos tras 30 días de digestión anaeróbica de paja de cebada al 5% p/v por el consorcio TACANA.
Figura 7. Identificación y cuantificación de AGVs individuales producidos tras 30 días de digestión anaeróbica de paja de cebada al 10% p/v por el consorcio TACANA.
Tabla 1. Algunas enzimas hidrolíticas bacterianas extracelulares producidas durante la digestión anaeróbica.
ENZIMAS | SUSTRATOS | PRODUCTOS |
Proteinasa | Proteinas | Aminoácidos |
Celulasa | Celulosa | Celobiosa, glucosa |
Hemicelulasa | Hemicelulosa | Glucosa, xilosa, manosa, arabinosa, galactosa, ácido glucorónico |
Amilasa | Almidón | Glucosa |
Lipasa | Grasas | Ácidos grasos, glicerol |
Pectinasa | Pectina | Galactosa, arabinosa, ácido poligalacturónico |
La concentración de AGVs totales es un importante indicador para el mo- nitoreo de la digestión anaeróbica y puede ser fácilmente determinada por titulación (Powell y Archer, 1989; Buchauer, 1998; Steyer y col., 2002). Éste in- dicador otorga información rápida y confiable sobre el estado del proceso en comparación con otros indicadores como el pH, la alcalinidad y la produc- ción de gas (Ahring y col., 1995; Björnsson y col., 2000; Hickey y Switzenbaum, 1991; Hill y Holmberg, 1988; Mechichi y Sayadi, 2005).
Sin embargo, la identificación y cuantificación de los AGVs individuales provee mucha más información sobre el estado del proceso de digestión anaeróbica. Estudios anteriores resaltan la importancia del ácido iso-butíri- co e iso-valérico (Cobb y Hill, 1991; Hill y Bolte, 1989), que actúan como in- dicadores de riesgo tempranos para predecir el fracaso o éxito global de la
digestión anaeróbica (Ahring y col., 1995; Cobb y Hill, 1991). Además, se ha sugerido que los niveles de ácido iso-butírico y n-butírico son los mejores in- dicadores de estrés (Ahring y col., 1995). Por tanto, la detección de los cam- bios metabólicos durante la digestión anaeróbica a través de la determina- ción de los AGVs individuales, es un parámetro importante para el control, optimización y éxito del proceso (Boe y col., 2007).
En el presente estudio, la concentración de AGVs totales se incrementó (de 8,1 ±0,24 a 10,2 ±0,2 g/L) al aumentar la concentración de paja de cebada (de 5 a 10% p/v, respectivamente), debido a una mayor disponibilidad de sustrato or- gánico. Aunque la concentración de AGVs totales permite monitorear el estado del proceso de la digestión anaeróbica, la técnica Headspace aplicada en éste estudio, permitió identificar y cuantificar de forma rápida y sencilla los AGVs in- dividuales que son indicadores más precisos. Así, se evidenció un aumento en la concentración de ácido acético (de 37,7 ±1,58 a 72,2 ±1,85 mM) y una dis- minución de ácido n-butírico (de 133 ±2,54 a 62,1 ±2,12 mM) al incrementar la concentración de paja de cebada (de 5 a 10% p/v, respectivamente). Estos datos indican la producción de diferentes cantidades de AGVs individuales al utilizar distintas concentraciones de sustrato orgánico durante la digestión anaeróbica. Adicionalmente, los cromatogramas obtenidos muestran varios picos sin iden- tificar con tiempos de retención inferiores al del ácido acético (2,71 min) situa- dos en un rango de 1,5 a 2,5 min (Figuras 6 y 7), posiblemente correspondientes a compuestos volátiles de menor peso molecular como el ácido fórmico y otros compuestos gaseosos como el metano, CO2, SH2 entre otros.
La identificación y cuantificación de AGVs individuales producidos durante la digestión anaeróbica de compuestos orgánicos, es un parámetro muy impor- tante debido al interés biotecnológico que tienen como materia prima para la producción no sólo de fuentes de energía renovables como el biogas y el bioe- tanol (Biorefinería), sino también para la producción de compuestos amigables con el medio ambiente como los poli-hidroxialcanoatos (Plástico biodegradable).
Al proyecto ASDI-SAREC por el apoyo y financiamiento de este trabajo.
