4
REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 3 (2015) 37-46
Estandarización de un método fluorométrico sobre trofozoitos de Giardia lamblia.
CORRESPONDENCIA: ALBERTO GIMÉNEZ AGIMENEZ@MEGALINK.COM
FECHA DE RECEPCIÓN: 25 DE MARZO DE 2015 FECHA DE ACEPTACIÓN 21 DE ABRIL DE 2015
Giardia lamblia es un protozoo intesti- nal que causa procesos diarreicos de gran impacto epidemiológico en nuestro país, especialmente en niños. Las drogas utiliza- das para el tratamiento son eficientes pero muchas producen efectos secundarios, de- bido a ello existen búsquedas de nuevos agentes antiparasitarios naturales y sintéti- cos por lo que existe la necesidad de con- tar con un método de evaluación antipara- sitario in vitro sensible, cualitativo y rápido.
En el presente estudio se estandarizo in vitro una técnica fluorométrica con el indi- cador resazurina, el mismo que tiene como base los cambios de oxido-reducción del compuesto resazurina (no fluorescente) a resorufina (fluorescente) debido a la reduc- ción química de las oxidoreductasas pre- sentes en las células viables.
Abstract
Giardia lamblia is an intestinal protozo- an that causes epidemiological impact of di- arrheal in our country, especially in children. The drugs used for treatment are efficient but many have side effects due to this there are research for new natural and synthetic antiparasitic agents so there is important to uses a sensitive, qualitative and fast method of in vitro antiparasitic evaluation.
In this in vitro study it was standardized technique with a fluorometric indicator re- sazurin, the same which is based on redox changes from resazurin (nonfluorescent) to resorufin compound (fluorescent) due to chemical reduction present in oxidoreduc- tases viable cells.
So for standardizing the fluorometric method we worked with a length of excita- tion and emission of 540 - 590nm respec-
1 Unidad de Evaluaciones biológicas, Área de Química Farmacéutica, Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Facultad de Cien- cias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andres. Av. Saavedra # 2224, Miraflores. La Paz, Bolivia
Así para la estandarización del método fluorométrico se trabajo con una longitud de excitación y emisión de 540 - 590nm res- pectivamente, determinando la población parasitaria de trabajo en un rango de 2,5x105 a 1,5 x106 trofozoitos /mL, el tiempo óptimo de incubación se midió a las 2, 3, 4, 5, 6 y 7 horas y la concentración de resazurina de 4mM, 2mM, 1mM, 0.5mM y 0.25mM.
Una vez obtenidos los datos se deter- mino de manera in vitro la IC50 de varios an- tiparasitarios convencionales para el trata-
miento de Giardia, trabajando con 7,5x105 trofozoitos /mL, tiempo de incubación 4 horas y concentración de aceptor de elec- trones 2mM, así mismo se trabajo con Al- caloides Totales de Corteza de la Evanta (Galipea longiflora) a una concentración de 100 ug/mL.
Obteniendo la IC50 de albendazol (0.4 uM), metronidazol (2.1 uM), tinidazol (1.5uM), mebendazol (0.81 uM) y CAT (77
ug/mL).
Logrando estandarizar finalmente un método fluorométrico, sensible y cuanti- tativo para las evaluaciones antiparasitarias dentro del I.I.F.B.
tively, determining the parasite population working in a range of 1.5 x106 2,5x105 tro- phozoites / mL, optimal incubation time from 2 to 7 hours and resazurin concentra- tion 4mM, 2mM, 1mM, 0.5mM and 0.25mm. Once the data determined was ob- tained, we worked in the IC50 of the con- ventional treatment of Giardia, working with 7,5x105 trophozoites / ml, 4 hours of incu- bation time and concentration of electron acceptor 2mM, we also determinate the an- tigiardiasis activity of total alkaloids cortex, CAT, of Evanta (Galipea longiflora). Getting the IC50 of albendazole (0.46 uM), met- ronidazole (3.12uM), tinidazole (1.22uM), mebendazole (0.43 uM) and CAT (77 ug/mL). Achieving finally standardize a fluoro- metric, sensitive and quantitative method for antiparasitic assessments within the IIFB
Giardia lamblia, Susceptibilidad, fluorométrico, Resazurina, Concentración Inhibitoria media (IC50).
KEY WORDS
fermedad asociada a la pobreza, en Bolivia existen estudios que indican que alrededor del 25% de la población esta infectada (Condori 2008, Alparo I., 2005; Barrientos et al., 2008) afectando mayormente a niños, constituyéndose en un problema de salud pública.
El tratamiento para esta enfermedad es importante desde un punto de vista económico y social, entre los medicamentos utilizados comprende ni- troimidazoles, quinacrina y furazolidona, la droga de elección es el metroni- dazol, aunque existen otras alternativas como el albendazol, sin embargo los efectos adversos que pueden producir que incluyen problemas gastrointes- tinales, nauseas, dolor de cabeza y leucopenia (Tracy & Webster, 1991) y la inaccesibilidad a estas drogas en ciertas comunidades, impulsa a probar te- rapias alternativas que ayuden a erradicar este problema, planteándose hi- pótesis de que ciertas plantas (semillas u hojas) contienen principios activos capaces de inhibir el crecimiento de Giardia lamblia tales son los estudios he- chos a Curcubita pepo (Barron Gonzales, 2012), Achyrocline satureioides, Eu- genia uniflora, Feoniculum vulgare, Psidiums guajava (Costa et al, 2009), Lip- pia spp. (Ponce- Macotela et al, 2006), Geranium niveum (Calzada et al, 1999), Hovenia dulcis (Gadelha et al, 2005) entre otros que sostienen resultados pro- metedores a nuevas sustancias terapéuticas antigiardiásicas.
Se han descrito diferentes métodos que permiten determinar la viabilidad ce- lular in vitro facilitado el desarrollo de técnicas de tamizaje a nuevos componentes antiparasitarios (Martinez - Barrio 2011). La técnica espectofotométrica de DPPH que emplea el radical 1,1-difenil-2-picrilhidracriles puede dar variables dispersas debido a que es un radical nitrogenado de larga vida, en algunos casos puede ser inerte y reaccionar lentamente (Barrón et al, 2012). La técnica de recuento celular utilizando colorantes vitales es laboriosa, consume tiempo, no es sensible y es un proceso subjetivo (Marrero-Ponce et al. 2009). Los métodos basados en la reduc- ción de la sal 3-(4,5- dimetiltiasol-2yl) -2,5- difenil tetrazolium bromide (MTT) por las deshidrogenasas mitocondriales de las células viables de cristales de formazan, presentes en los cultivos. Estos métodos son ampliamente utilizados, sin embargo el producto final de esta sal (formazan) es insoluble en agua, por lo que se utiliza solventes orgánicos para solubilizarlo (Calzada et al, 1999), la utilización de análo- gos de MTT como el XTT sodio (2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2-h-tetra- zolium-5-carboxanilide) técnica también realizada en el IIFB sin tener resultados satisfactorio debido a la oxidación del medio de cultivo (TYIS-33). La mayoría pre- sentan desventajas por ser de punto final, imposibilitando seguir el comportamien- to celular después de ser sometidas a un tratamiento traumático.
La resazurina es un colorante redox que se utiliza para cuantificar la prolife- ración y observar la citotoxicidad en diferentes tipos celulares (Skehan, 1992). En un utilizaba para determinar contaminación por bacterias u hongos. Exhi- be cambios colorimétricos y fluorométricos relacionados a la actividad celular metabólica (Zhang H, 2004). La técnica se basa en la capacidad de células ac- tivas metabólicamente que reducen en la mitocondria la resazurina a resoru- fina y dihidroresorufina donde la forma oxidada, resazurina ingresa al citosol y es convertida a la forma reducida por la actividad enzimática mitocondrial aceptando electrones del NADPH, FADH, GMNH, NADH (Makiuchi, 2013).
Figura 1. Reducción de Resazurina (no fluorescente) a resorufina (fluorescente)
La reducción produce que la resazurina oxidada o no fluorescente la re- duzca o cambie a la forma fluorescente, resorufina.
Cepas utilizadas para los ensayos Los trofozoitos de Giardia lamblia fue- ron donados por la Unidad de Parasitología de la Universidad Complutense de Madrid, España (2009). Se conservaron en medio TYIS-33 modificado (pH 7.2), se lleno por completo el tubo con el medio debido a que son parasitos anaerobios facultativos, se incubaron de 37ºC. Cada 100 ml. de medio contie- ne: 0.1g K2HPO4 , 0.06g de KH2PO4, 0.1 g NaCl, 3g Extracto de levadura, 0.05g Bilis bovina deshidratada, 1g de glucosa, 0.2g L-cisteina HCl, 0.02g ácido as- córbico, 2.2mg citrato férrico amónico, suplementado con 15 % de suero bo- vino fetal (SBF) y 3% de solución de vitaminas (Sigma - Aldrich).
Curva de crecimiento de Giardia lamblia Para conocer la cinética de crecimiento parasitaria se realizó la curva de crecimiento, el proceso consistió en hacer una solu- ción madre con una concentración final de 2x104 trofozoitos /mL con TYIS-33 modi- ficado, luego alicuotar en 10 tubos de 1,5mL. El trabajo se hizo por triplicado. Reali- zando el recuento celular diariamente en cámara de Neubauer.
Se hizo una dilución a partir de un cultivo in vitro de trofozoitos en fase de cre- cimiento logarítmico con una concentración de 1,5 x106 trofozoitos/mL a partir de la cual se realizo diluciones seriadas 1/2 abarcando concentraciones entre 1,5 x106 hasta 2,5x105 trofozoitos/mL, los cuales fueron distribuidos en placas de cultivo de 96 pozos (Cellstar) por duplicado a tres repeticiones, a cada pozo se añadió 10μL de la solución de resazurina (Sigma Aldrich) a diferentes concentraciones (4, 2, 1, 0.5, 0.25mM) los tiempos de incubación fueron 2,3,4,5, 6 y 7 horas. Las placas fue- ron leídas en un lector de Fluorescencia (SYNERGYHT, Biotek) a una longitud de excitación y emisión de 540 y 590 nm respectivamente. A partir de los datos, se ob- tuvo curvas de fluorescencia en función a las concentraciones de parásitos y con- centración de Resazurina, para los diferentes tiempos de incubación.
Antiparasitarios convencionales fueron adquiridos en la farmacia institu- cional utilizados para la estandarización.
Albendazol 400mg
Metronidazol 100 mg
Tinidazol 500 mg
Mebendazol 1000 mg
Corteza Alcaloides Totales de Evanta (CAT) 100ug/mL
Se disolvieron en Dimestil sulfoxido (DMSO) para obtener una concentra- ción de 100ug/mL y se hicieron diluciones seriadas a partir de 1ug/mL hasta 0,007 ug/mL a partir de la solución madre.
Mientras que de CAT se hicieron diluciones de 100, 50, 25 y 12,5ug/mL.
Tabla 1. Concentraciones de antiparasitarios convencionales y CAT utilizados para la estandarización del método.
Diluciones antiparasitarias con DMSO ug/mL | 1 | 0.5 | 0.25 | 0.125 | 0.06 | 0.03 | 0.015 | 0.007 |
Diluciones de CAT con DMSO ug/mL | 100 | 50 | 25 | 12,5 | ||||
Se hizo una dilución 1/10 del cultivo de trofozoitos con glutaraldehido 2.5% para fijar los parásitos y realizar el recuento en cámara de Neubauer. Se ajusto la población a 7,5x105 trofozoitos/mL con medio TYIS-33 modificado, se los distribuyo en placas de 96 pozos (Cellstar) en un volumen de 100μL. A continuación se procedió a añadir las distintas concentraciones de las drogas control a evaluar en volumen similar al de los parásitos, se realizo un control de crecimiento parasitario es decir 100 uL de parásitos ajustados a la concen- tración ideal mas 100μL medio TYI-S-33, como blanco se utilizo el medio de cultivo. A la placa se añadió (10μL/pozo) una solución de resazurina en buffer fosfato salino (pH 7.0) dentro de un CandleJarr un recipiente cerrado de vi- drio con una llave de paso en la tapa y una vela encendida en su interior de tal modo que permita la salida del oxigeno y la saturación en el interior del anhí- drido carbónico, requerida para el crecimiento de los trofozoitos de Giardia. Las placas se incubaron durante 4 horas a 37°C.
Pasado el tiempo de incubación se procedió a la lectura de fluorescencia y determinación de la IC50, con longitud de excitación y emisión de 540 y 590 nm respectivamente, el análisis de datos fue realizado en el programa Gen5, transformando el índice de fluorescencia en porcentaje de viabilidad de los parásitos, donde el 100% representa la fluorescencia del control de parási- tos sin droga.
Fig.2. Curva de crecimiento de trofozoitos de Giardia con recuento diario (12 días).
*cada recuento se realizo por triplicado.
Se realizo la curva de crecimiento de Giardia observándose que en los días 5, 6 y 7 hubo el máximo crecimiento por mL y a partir del día 11 las concen- traciones parasitarias disminuyen.
Fig. 3. Para la estandarización del método Fluorométrico la mejor linealidad (R2=0.96) se obtuvo con la concentración de 2mM de resazurina.
La medición de la fluorescencia a diferentes concentraciones de resazuri- na y población parasitaria, nos muestra que la mayor emisión de fluorescen- cia es con una concentración de 4mM de resazurina pero la mejor linealidad (R2= 0,96) se obtiene con la concentración de 2mM y la concentración parasi- taria que presente una fluorescencia significativa es de 7.5 x105 trofozoitos/mL.
Fig.4. Comparación de la emisión de fluorescencia (UFR) por la resazurina en diferentes tiempos con una concentración de 7.5 x105 trofozoitos de Giardia /mL
En cuanto a la determinación del tiempo se observa que a las 4 horas la emisión de fluorescencia empieza a ser significativa para las concentraciones de rezasurina 2 y 4 mM.
Tabla 2. Resultados de la Concentración Inhibitoria media IC50 de antiparasitarios convencionales y CAT frente a Giardia lamblia. Obtenido del programa Gen5.
Anitparasitarios convencionales | IC50 obtenida con el programa Gen5 +SD | IC50 obtenido por otros autores |
Albendazol 400mg | 0.4 + 0.03 uM | 0.21 uM (Arguello et al,2004) |
Metronidazol | 2.1 +0.18 uM | 1,96 uM (Busatti H, 2007) |
Tinidazol | 1.5 +0.15 uM | 4.1 uM (Arguello et al, 2004) |
Mebendazol | 0.81+ 0.012 uM | 0,7 uM (Arguello et al,2004) |
CAT | 73.3 + 3.5 ug/mL |
Se determino la curva de crecimiento in vitro de los cultivos de trofozoitos de Giardia pudiendo observarse que el día 2, luego de la etapa de adaptación, empieza el crecimiento logarítimico de Giardia teniendo así los días 5, 6 y 7 como máximos picos de crecimiento logarítmico (Figura2). similares a los que obtuvo Karapetyan en 1963; mientras que Gonzales y Castro en 1986, mostraron que los mayores cre- cimientos fueron durante los días 4, 5, y 6 indicando un descenso del crecimiento en los días sucesivos utilizando medio BI-S-33. Por lo que para los ensayos de es- tandarización se utilizo cultivos de parásitos de 2 días de incubación puesto que los parásitos se encuentran adaptados al medio de cultivo y metabólicamente activos.
En la Figura 3, se observa una respuesta lineal de la fluorescencia al incremento del número de parásitos siendo la población de 7,5x105 trofozoitos/mL a una con- centración de 2mM de resozurina la que presenta un R2 de 0,96 mostrándo cam- bios de URF de fluorescencia significativos a los cambios de población, variable im- portante a la hora de medir la IC50 de los compuestos antiparasitarios.
Si bien existen trabajos en donde se utilizan concentraciones bajas de trofozoi- tos 2x104 trofozoitos/mL (Barron Gonzales, 2007), 5x104 trofozoitos/mL (Cedillo – Rivera, 1992) estas no serian significantes para determinar cambios de población buscados y no existirían cambios en la flurescencia ideales; según Arguello-Garcıa et al., 2004, trabajo con poblaciones de alrededor de 1x106 trofozoitos/mL y Ponce Macotela et al 1,5 x106 trofozoitos/mL en nuestro caso produciría una saturación en cuanto la emisión de fluorescencia.
Por otro lado en base a los resultados obtenidos de población parasitaria y con- centración de resazurina se determino el tiempo de incubación (figura 4) pudien- do observar una correlación lineal al aumento de tiempo de incubación teniendo una linealidad significativa a 2mM y 4 horas de incubación con un buen coeficien- te de correlación lineal (R2=0,91)
Mediante estos parámetros se confirmo la eficacia antiparasitaria in vitro de va- rios compuestos usados para el tratamiento de esta enfermedad así se verifico la mejor respuesta del albendazol y mebendazol respecto al metronidazol frente a trofozoitos de Giardia con IC50 de albendazol (0,4 uM), metronidazol (2.1 uM), tini- dazol (1,5 uM) y mebendazol (0.81 uM) acercándose a resultados obtenidos ante- riormente por estudios de susceptibilidad. (Arguello et al, 2004; Busatti et al, 2007; Echevarria A, 2001) permitiéndonos confirmar la validez de la técnica, trabajando con una concentración de parasitos de 7,5 x105 trofozoitos/mL con un tiempo de incubación de 4 horas validando de esta manera el método fluorométrico.
Las enfermedades parasitarias son un problema de salud publica en todo el mundo especialmente en países en vías de desarrollo si bien existen tratamientos estos presentan efectos secundarios indeseables como ser molestias gastrointes- tinales, náuseas, dolor de cabeza y leucopenia incluso provocando casos de re- sistencia, por lo que surge la necesidad de encontrar nuevos agentes o entidades químicas con actividad antiparasitarias, utilizando nuevas técnicas laboratoriales constituyéndose la estandarización de este método fluorométrico en una herra- mienta sensible y cuantitativa de evaluación no solo de drogas antiparasitarias sino que además sirve para iniciar la búsqueda de una bioprospección de plantas me- dicinales en el Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas.
Este estudio fue parcialmente financiado por el proyecto ASDI-SAREC 2014 a quien expresamos un especial agradecimiento. Asimismo a la doctora Maria Auxiliadora Dea Ayuela, profesora en Farmacia de la Universidad Com- plutense de Madrid, España, por la donación de cepas parasitarias.
