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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 3 (2015) 17-26
Evaluación in-vitro del efecto de la curcumina y curcumina dietil succinato sobre la viabilidad y producción de IL-6 en cultivos celulares de cáncer de mama
CONDORI S., RAMIRO1 ROJAS H., RICARDO 2
DRA. GUTIÉRREZ A., ROXANA J.3
PHD, MS, BS PINO-FIGUEROA, ALEJANDRO4
CORRESPONDENCIA: RAMIRO.RCS@OUTLOOK.COM
FECHA DE RECEPCIÓN: 9 DE ABRIL DE 2015 FECHA DE ACEPTACIÓN: 14 DE MAYO DE 2015
Curcumin is a polyphenol used as natural dye obtained from Turmeric (Curcuma Longa) which is native from India. Different studies have identified the curcumin as the most ac- tive metabolite of turmeric (Curcuma Longa); in-vitro studies demonstrate anti-inflamma- tory, anti-oxidant and anti-cancer activity of curcumin. This research was carried out in the Laboratory of Farmacology from the Massa- chusetts College of Pharmacy and Health Sci- ences University, Boston, USA in the period from May to August in order to assess the ac- tivity of curcumin and curcumin diethyl suc- cinate (analogous synthetic compound of cur- cumin with increased stability) over the cellular viability and one of the mechanisms of prolif- eration and metastasis of breast cancer, which is the IL-6 production. We used cell cultures of breast cancer (MDA-MB 231 cell line) treated
1 y 2 Internos del Programa Profesional de Farmacia y Bioquímica, Facultad de Cs. Farmacéuticas, Bioquímicas y Biotecnológicas, UCSM. Calle Arequipa Nº 100, Cerro Colorado, Arequipa. Telf: 995795277
Docente Principal Facultad de Cs. Farmacéuticas, Bioquímicas y Biotecnológicas UCSM, Arequipa-Perú.
Assistant Professor of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy. MCPHS University Boston-USA.
with curcumin and curcumin diethyl succinate in different concentrations: 1 uM, 3 uM and 10 uM in both cases. After incubation of 24 hours, it was determined the cellular viability with tripan blue and MTS assay, the concentra- tion of IL-6 was determined by ELISA (Enzyme Linked Assay by immunoabsorption). Our re- sults showed a decrease in the proliferation of cancer cells (viability) with both curcum- ins compared with the control group, being the viability of the cultures treated with cur- cumin lower than the cells with diethyl succi- nate curcumin.
In relation to the IL-6 production, it was confirmed that cancer cells produce very high concentrations of this cytokine (90-98 pg / ml, values corresponding to the controls used), which were visibly reduced after cell incuba- tion with curcumin and diethyl succinate cur- cumin at concentrations of 1, 3 and 10 uM. Also, it was shown statistically that curcum- in produced a greater reduction in IL-6 levels than the diethyl succinate curcumin in concen- trations of 3 and 10 uM, however at 1 uM the synthetic curcumin was more efficient. When we relate the reduction of cell viability caused by both curcumins, with the production of IL- 6, it was observed that there is not a direct re- lationship between such parameters because even with the significant decrease in cell pro- liferation induced by curcumins, IL-6 produc- tion in cell cultures remained higher than the values observed in healthy cells.
It was concluded that curcumins modi- fy cell morphology of cancer cells, reducing their viability and IL-6 production, not having found a direct relationship between these two variables.
KEY WORDS
IL-6 (interleucina 6), viabilidad celular, curcumina, curcumina dietil succinato, células de cáncer de mama
Turmeric (Cúrcuma longa) es una planta herbácea perenne rizomatosa de la fa- milia del jengibre, Zingiberaceae, originaria del sureste de la India, Los componen- tes químicos más importantes de la cúrcuma son un grupo de compuestos llamados curcuminoides, que incluyen la curcumina (diferuloylmethane), demetoxicurcumi- na, y bisdemetoxicurcumina. El compuesto mejor estudiado es la curcumina, que constituye en promedio el 3,14% de la cúrcuma en polvo1.
La curcumina es el principal curcuminoide de la especia turmeric, popularmen- te conocida como palillo en nuestro país, usada como colorante natural por la in- dustria alimentaria en la que se le denomina con el código E1002. El interés de los investigadores sobre el estudio de sus prodiedades biológicas en los últimos años ha llevado a la realización de numerosas investigaciones in-vitro, en las que se ha demostrado su actividad anti-inflamatoria, anti-oxidante y anti-cancerigena3,4,5,6.
El cáncer de mama es una proliferación maligna de las células epiteliales que revisten los conductos o lobulillos de la mama, es el cáncer de mayor incidencia en la población femenina durante las consultas médicas oncológicas y actualmen- te su tratamiento se basa principalmente en la quimioterapia, radioterapia, terapia coadjuvante, terapia biológica y cirugía, dependiendo del estadío de la enferme- dad7. Una estrategia para el manejo de esta patología se basa en el conocimiento de los mecanismos moleculares de proliferación, apoptosis y metástasis del cán- cer. Actualmente se encuentran en estudio numerosos blancos moleculares, sien- do uno de ellos la participación de la IL- 6 en procesos cancerígenos8,9. IL-6 es una citoquina pleiotrópica, perteneciente a la familia de las eritropoyetinas, interactúa con su receptor de citoquinas de clase II (receptor de eritropoyetinas), el receptor tiene actividad tirosinoquinasa desencadenando su mecanismo por la activación de la ruta de señalización JAK/STAT la que concluye modulando la expresión ge- nética. Este mecanismo se ha estudiado en diferentes tipos de cáncer habiéndose encontrado que procesos oncológicos necesarios para el desarrollo de una célula cancerígena como la angiogenesis, proliferación celular y metástasis involucran la participación de IL-610,11.
Las células de cáncer de mama (línea celular MDA-MB 231) fueron sus- pendidas en DMEM (Dulbecco´s Modified Essential Medium) conteniendo 10% de FBS (suero fetal bovino) y 1% de AB (solución de Penicilina-Estrepto-
micina) por un periodo de 6 a 8 días, después del periodo de incubación se aíslan para trabajo experimental y/o subcultivo de una nueva generación de células para posterior uso.
El ensayo de exclusión de azul de tripán o viabilidad celular se realizó para la selección de los cultivos celulares aptos para trabajo experimental y/o sub- cultivo, usando exclusivamente los cultivos con 95% de viabilidad. Estos da- tos junto con el conteo celular se obtuvieron usando el Cellometer® Auto T4.
CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) es un método colorimétrico para determinar el número de células viables en ensa- yos de proliferación y citotoxicidad. Se realizó el ensayo en una placa de 96 pozos, con aproximadamente 1x10E5 células/pozo, procedentes de medios de cultivo previamente incubados con curcumina (1uM, 3uM, 10uM) o curcu- mina dietil succinato (1uM, 3uM, 10uM). La lectura se efectuó a una longitud de onda de 490nm utilizando un espectrofotómetro para microplacas.
Se determinaron los niveles de IL-6 mediante ELISA, a partir del sobrena- dante de los diferentes grupos experimentales de cultivos de células cáncer de mama en placas de ELISA de 96 pozos. Dado que es un ensayo colorimé- trico, las placas fueron analizadas en un espectrofotómetro para microplacas.
Los resultados fueron evaluados mediante el paquete estadístico Minitab 16, a través del cual se calcularon los siguientes estadígrafos: Medidas de ten- dencia central, media, error estándar, ANOVA, Prueba de Tukey.
En la Figura 1 se observa la morfología de los cultivos celulares MDA-MB 231: en su estado natural (recuadro 1), después de haber sido expuestas a dis- tintas concentraciones de curcumina y curcumina dietil succinato (recuadros 2 a 7). Los cambios observados en la morfología celular sugieren que las célu- las de cáncer de mama se encuentran en estado apoptótico
Figura 1. Morfología de la Línea Celular MDA-MB 231 a distintas concentraciones de Curcumina VS Curcumina Dietil Succinato
La Gráfica 1 muestra en porcentaje la población celular de cáncer de mama después de haber sido expuesta a la curcumina en concentraciones de 1,3 y 10 uM. El análisis estadístico indica que hay diferencia significativa en- tre el grupo control y los grupos tratados con curcumina, el grupo tratado a 1 uM es diferente de los tratados a 3 y 10 uM, y en entre estos dos últimos no hubo diferencia significativa.
Gráfico 1. Ensayo de citotoxicidad con Curcumina
Población de MDA-MB 231
120
Control
100
1uM
20
3uM
13
10uM
9
% viabilidad
100
80
60
40
20
0
Se observa en porcentaje la población celular de cáncer de mama después de haber sido expuestas a la curcumina dietil succinato a concentraciones de 1,3 y 10 uM (Gráfica 2). El análisis estadístico indica que hay diferencia signi- ficativa entre todos los grupos.
Gráfico 2. Ensayo de citotoxicidad con Curcumina dietil succinato
Población de MDA-MB 231
120
Control
100
1 uM
59
3uM
37
10uM
16
% viabilidad
100
80
60
40
20
0
Se compara la viabilidad de los cultivos de cáncer de mama con trata- miento de ambas curcuminas (Gráfica 3). El análisis estadístico muestra que la curcumina es mejor que la curcumina dietil succinato.
Gráfico 3. Viabilidad con Curcumina VS Viabilidad con Curcumina Dietil Succinato
1 uM
20
59
3uM 13
37
10uM
9
16
70
60
% viabilidad
50
40
30
20
10
0
MDA-MB 231 Curcumina
MDA-MB 231 Curcumina DS
En la Gráfica 4 se puede ver la producción a 24 horas de IL-6 de las célu- las de cáncer de mama después de haber sido expuestas a la curcumina a 1, 3 y 10 uM. El análisis estadístico indica que hay diferencia significativa entre el grupo control y los grupos tratados con curcumina. También hubo diferen- cia entre el grupo a 1 uM y los grupos de 3 y 10 uM, estos dos últimos resul- taron ser iguales.
Concentración de IL-6 en pg/ml
Producción de IL-6
(pg/ml)
120
Control
98
1uM
42
3uM
18
10uM
14
100
80
60
40
20
0
Gráfico 4. Producción de IL-6 con Curcumina
Se observa la producción a las 24 horas de IL-6 de las células de cáncer de mama después de haber sido expuestas a la curcumina dietil succinato a 1,3 y 10 uM (Gráfica 5). El análisis estadístico indica que hay diferencia significati- va entre el grupo control y los grupos tratados con curcumina dietil succina- to, mas no entre éstos mismos.
Control
98
1 uM
28
3uM
33
10uM
26
Concentración de IL-6 en pg/ml
Gráfico 5. Producción de IL-6 con Curcumina Dietil Succinato 120
100
80
60
40
20
0
Producción de IL-6
(pg/ml)
En la Gráfica 6 se compara la producción de IL-6 de los cultivos de cáncer de mama con tratamientos de ambas curcuminas, el análisis estadístico indi- ca que la curcumina produce mejor reducción de IL-6 a 3 y 10 uM, a 1 uM la curcumina sintética fue mejor.
1 uM
42
28
3uM 18
33
10uM
14
26
Concentración de IL-6 en pg/ml
Gráfico 6. Producción de IL-6 con Curcumina VS Producción de IL-6 con Curcumina Dietil Succinato 50
40
30
20
10
0
Producción de IL-6 Curcumina Producción de IL-6 Curcumina DS
En la Gráfica 7 se aprecia en barras rojas la producción esperada de IL-6 de las células de cáncer de mama después de haber sido tratadas con curcu- mina a 1, 3 y 10 uM; y en barras verdes la producción que se obtuvo en el en- sayo de ELISA.
Gráfico 7. Producción de IL-6 estimada VS Producción real de población celular tratada con Curcumina
|
| ||||||||
100% viabilidad control 98 98 | 20% viabilidad 1uM 20 42 | 13% viabilidad 3uM 13 18 | 9% viabilidad 10 uM 9 14 | ||||||
120
Producción de IL-6 en pg/ml
100
80
60
40
20
0
Producción estimada de IL-6 (pg/ml)
Producción real de IL-6 (pg/ml)
Se observa en barras rojas la producción esperada de IL-6 de las células de cáncer de mama después de haber sido expuestas a la curcumina a concen- tración de 1, 3 y 10 uM; y en barras verdes la producción que se obtuvo en el ensayo de ELISA sándwich.
Gráfico 8. Producción de IL-6 estimada VS Producción real de población celular tratada con Curcumina Dietil Succinato
100
Producción de IL-6 en pg/ml
80
60
40
20
0
Producción estimada de IL-6 (pg/ml)
Producción real de IL-6 (pg/ml)
100% viabilidad control
90
90
59% viabilidad 1uM
53
28
37% viabilidad 3uM
33
33
16% viabilidad
10 uM
14
26
Se aprecia en barras rojas la producción esperada de IL-6 de las células de cáncer de mama después de haber sido tratadas con curcumina dietil succi- nato a 1, 3 y 10 uM (Gráfica 8); y en barras verdes la producción que se obtu- vo en el ensayo de ELISA
Entendiendo los principales mecanismos moleculares en el progreso y agresividad del cáncer de mama, es esencial la identificación de nuevos blan- cos farmacológicos para su intervención y más aún en el cáncer de mama tri-
ple negativo, el cual es insensible a algunos de los tratamientos más eficaces disponibles, incluyendo el tratamiento dirigido al HER2 como el trastuzumab, los tratamientos endocrinos como el tamoxifeno y los inhibidores de la aro- matasa. Es así que se decidió trabajar con la línea celular MDA-MB 231, la cual es una línea representante del cáncer de mama triple negativo.
En nuestra investigación encontramos que la curcumina y curcumina dietil succinato tienen efecto citotóxico aparentemente apoptótico sobre la pobla- ción de células de cáncer de mama, ya que después de ambos tratamientos hubo cambios en la morfología natural de la línea celular.
La viabilidad después de los tratamientos se vio disminuida con ambas curcuminas probablemente a que estas modulan mecanismos relacionados con la proliferación celular, rutas de supervivencia, vías de activación de las caspasas, la actividad de proteínas tirosino-quinasa, etc.
Se pudo corroborar que los niveles de IL-6 producidos por las células de cáncer fueron elevados ya que en diversos estudios se ha demostrado que la IL-6 contribuye al crecimiento y progresión de varios cánceres y tumores por medio de la ruta de señalización JAK/STAT, la que concluye modulando la ex- presión genética de oncogenes.
Los niveles de IL-6 fueron reducidos con ambos tipos de curcumina debi- do a la disminución de la población celular, pero al analizar si las curcuminas actúan directamente sobre la producción de esta citocina, se observó que no hay relación directa ya que éstas estuvieron más elevadas de lo esperado en comparación con los niveles normales y que probablemente se trate de un mecanismo de supervivencia por parte de las células cancerígenas.
Se observó una morfología apoptótica de los cultivos celulares MDA-MB 231 en presencia de la curcumina y curcumina dietil succinato. Concentracio- nes de 3 y 10 uM para la curcumina, y de 10 uM para la curcumina dietilsuc- cinato mostraron mayor grado de citotoxicidad. La curcumina produjo ma- yor reducción de la viabilidad que la curcumina dietil succinato en todas las concentraciones empleadas. En los cultivos celulares tratados con diferentes concentraciones de ambas curcuminas se observó una notable disminución de IL-6. Las concentraciones que mostraron mayor reducción en los niveles de IL-6 fueron las de 3 y 10 uM para la curcumina, y en el caso de la curcumi- na sintética las tres concentraciones mostraron igual efectividad. Se demos- tró estadísticamente que la curcumina produjo una mayor reducción en los niveles de IL-6 que la curcumina dietil succinato en concentraciones de 3 y 10 uM., siendo más eficaz la concentración de 1 uM para la curcumina sintética. Se observó que no existe una relación directa entre la disminución de la via- bilidad celular y la producción de IL-6.
