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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 2 (2014) 37-46
Evaluación de la actividad anti-Helicobacter pylori del Aceite Esencial y Acido Ursólico de Clinopodium bolivianum (Khoa) por
el método de impregnación de disco
MAMANI, MARISEL1 GONZALES, EDUARDO1 MAMANI, BENIGNO1
CORRESPONDENCIA: EDUARDO GONZALES EDUARDO.GONZALES@GMAIL.COM
FECHA DE RECEPCIÓN: 16 DE ABRIL DE 2014 FECHA DE ACEPTACIÓN 30 DE JULIO DE 2014
Helicobacter pylori es una bacteria que tiene una relación directa con el desarrollo de la enfermedad gastroduodenal. Se esti- ma que más del 50% de la población mun- dial está infectada por esta bacteria. La te- rapia empleada para la erradicación de la bacteria falla en más del 20%, principal- mente por la generación de resistencia a los antibióticos comerciales. De tal mane- ra, es importante controlar esta enferme- dad, buscando nuevos tratamientos y/o compuestos que sean más específicos, me- nos tóxicos y de fácil acceso a la población. Las plantas medicinales constituyen poten- ciales fuentes para el descubrimiento y de- sarrollo de nuevos agentes efectivos con- tra la infección por esta bacteria. En el área de Farmacología del Instituto de Investiga- ción Fármaco Bioquímicas de la Facultad
Abstract
Helicobacter pylori are a bacterium that has a direct relationship with the de- velopment of gastroduodenal disease. It is estimated that over 50 % of the world pop- ulation is infected with this bacterium. The therapy used to eradicate the bacteria fails by more than 20 %, mainly due to the gen- eration of resistance to commercial anti- biotics. Thus, it is important to control this disease, finding new treatments and / or compounds which are more specific, less toxic and easily accessible to the popula- tion. Medicinal plants are potential sources for the discovery and development of new agents effective against infection by this bacterium. In the area of Pharmacology, In- stitute of Drug Biochemical Research, Fac- ulty of Pharmaceutical Sciences and Bio- chemical carried out several studies on the
1 Área de Farmacología del Instituto de Investigaciones Fármaco-bioquímicas, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Univer- sidad Mayor de San Andrés,, Av. Saavedra No.2224, La Paz, Bolivia.
plants of the Bolivian herbal medicine, in this case by conducting studies on the sec- ondary metabolites of plants to natural therapeutics, based on traditional medi- cine. . In recent years the use of tradition- al medicine for the treatment of common human diseases has increased, however the traditional knowledge provided medical and / or healers are empirical and transmit- ted from generation to generation whose treatment based on practice and observa- tion. These treatments do not have a sci- entific basis to prove their pharmacolog- ical efficacy. For this reason it should be scientifically validate the effect of medici- nal plants, to identify the active ingredients and their activity against Helicobacter pylo- ri. The present study is the evaluation of the essential oil and Ursolic Acid from Clinopo- dium bolivianum, which do not have stud- ies of anti - Helicobacter pylori activity.
Helicobacter pylori, Clinopodium bolivianum, Acido Ursólico y Aceite esencial.
KEY WORDS
Desde el descubrimiento de los investigadores australianos Warren y Mar- shall después de haber realizado cultivos de Helicobacter pylori, al principio de la década de los años 80, se llegaron a realizar numerosos estudios sobre la microbiología de esta interesante bacteria, la cual tenía una característica en particular. Helicobacter pylori es un espiral Gram negativo microaerofílico que infecta la mucosa gástrica humana y está asociado con el desarrollo de diversas enfermedades digestivas como ser: la gastritis, ulcera gastroduode- nal, adenocarcinoma gástrico y con el desarrollo del linfoma gástrico de célu- las B del tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT), (Yakoob, J., et al., 2008).
Más de 25 años después de haber aislado por primera vez esta bacteria, aún no se ha encontrado en el mundo el tratamiento óptimo de erradicación del Helicobacter pylori; así, incluso las combinaciones más efectivas actual-
mente disponibles fracasan en aproximadamente un 20% de los casos (Gis- bert, 2011). Se ha observado que el 70 a 90% de los pacientes con úlcera gás- trica o duodenal se encuentran infectados con H. pylori y que el tratamiento combinado utilizando antibióticos (amoxicilina y claritomicina) y un anti se- cretor (omeprazol) produce la erradicación del microorganismo en un 80- 90% de los casos (Vu, C., Ng, Y. 2000). Estos fracasos en la erradicación están relacionados a la falta de adherencia al tratamiento, la resistencia bacteriana y los efectos adversos de estos tratamientos (Francesco, et al. 2010).
En estudios realizados en la ciudad de La Paz, Bolivia, demuestran que aproximadamente el 50% de la población presenta infección por Helicobac- ter pylori (Bilbao, P. 2006). El uso de la quimioterapia para erradicar a Helico- bacter pylori es bastante compleja fastidiosa, y costosa. Bolivia tiene elevados índices de pobreza, por lo que resulta costoso para algunas familias acceder al tratamiento. El aumento de la prevalencia de esta enfermedad en la po- blación y la necesidad de disminuir los efectos que esta produce ha sido el estímulo de muchos científicos para el desarrollo de nuevas técnicas y me- dicamentos seguros para la población, estudiándose también alternativas na- turales o derivados semisintéticos de productos naturales que ayuden a curar o prevenir el desarrollo de esta patología y sus efectos. Rescatando de esta manera los conocimientos de nuestras etnias y culturas, las mismas que sugie- ren terapias alternativas en base al uso de plantas medicinales. Algunos pro- ductos naturales han sido reportados como antiulcerogénicos en modelos de úlcera gástrica en animales (Lewís, D.A., Hanson, P.J. 1991)
Debido a los diversos estudios realizados en el ámbito científico con el fin de mitigar la propagación de esta bacteria, se ha estado buscando una alter- nativa terapéutica, a base de compuestos naturales, estudios anteriores desa- rrolladas en el Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas UMSA, rea- lizó el análisis preliminar contra esta bacteria: uno de los trabajos realizados fue un estudios sobre la actividad anti- Helicobacter pylori in vitro con el uso de plantas medicinales como ser: Calendula officinalis (Calendula), Clinopo- dium bolivianum (Khoa), Piper elongatum (Matico), Plantago major (Llantén), Verbena officinalis (Verbena) y Rubus boliviensis (Khari-khari). Se ha eviden- ciado que los extractos diclorometánico, hidroalcohólico y acuoso de Clinopo- dium bolivianum, y Piper elongatum, tienen actividad anti-Helicobacter pylori al igual que el extracto hidroalcohólico de Plantago major (Claros P. M., et al 2007) mostrando resultados alentadores. En la misma línea de investigación se realizó otro estudio de la “Evaluación de la actividad anti-Helicobacter pylori del Clinopodium bolivianum, y Piper elongatum mediante la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) por agar en dilución. Se determi- nó que el extracto diclorometanico de Clinopodium bolivianum (Khoa) tiene actividad anti- Helicobacter pylori definida con un MIC de 64 ug/mL presen- tando solamente 6.06% de cepas resistentes (Quisbert, M., 2009).
La finalidad de este trabajo es complementar los estudios ya citados rea- lizados en el Instituto de Investigación Fármaco Bioquímicas, la finalidad de utilizar nuestros recursos naturales, como una alternativa al tratamiento de Helicobacter pylori. Los extractos Acuoso, Hidroalcoholico y Diclorometani-
co de la especie Clinopodium bolivianum, mostro actividad contra la bacte- ria, la finalidad de este trabajo es de evaluar al compuesto mayoritario (Áci- do Ursólico), y el aceite esencial, sobre la actividad Anti-Helicobacter pylori ya que sobre estos compuestos no se tiene reportes. En el año 2011 se llegó a aislar e identificar el Ácido Ursólico (Acido 3 beta-hidroxiurs-12-en-28 oico) como producto mayoritario de la especie Clinopodium bolivianum identifi- cado mediante los espectros de resonancia magnética unidimensional y bi- dimensional (Mamani B., 2011). Otro estudio realizado por Figueroa 1997 se- ñala que los aceites esenciales de Clinopodium bolivianum poseen actividad antibacteriana in vitro sobre Staphylococcus aureus (coco gram positivo), Ba- cillus subtilis, Shigella flexneri, Escherichia coli y Salmonella enteritidis (ba- cilos gram negativo), pero ningún estudio se realizó sobre la Helicobacter pylori. El ácido Ursólico es un compuesto triterpénico pentacíclico que está presente en numerosas especies vegetales.
La especie Clinopodium bolivianum fue recolectado en el mes de febrero del año 2012. En la comunidad Tanca, cantón Compi, provincia Murillo depar- tamento de La Paz. Se realizó el secado de la planta y fue llevado al herbario nacional de Bolivia para su autentificación y clasificación.
Con la planta seca se realizó la extracción del aceite Esencial por la técnica de arrastre de vapor. Para la obtención del compuesto mayoritario Acido Ursó- lico, se pidió la colaboración del Lic. Benigno Mamani (Licenciado en Química) en la proporción del compuesto debido a que, en el año 2011 realizo la extrac- ción e identificación del compuesto mayoritario del Clinopodium bolivianum. En el instituto de investigación de la facultad de Ciencias Puras y Naturales con la colaboración del Instituto de Investigación Fármaco Bioquímicas UMSA.
Se obtuvieron cepas salvajes de Helicobacter pylori, cedidas en medio de caldo urea por el laboratorio de Microbiología del Hospital Arco Iris. Una vez trasladadas las muestras de biopsias al laboratorio de Microbiología del IIFB, con la ayuda de un hisopo estéril se procedió a estrujar la muestra de biop- sia presionándola contra las paredes del tubo para la cual es sembrada inme- diatamente en medio de cultivo. El medio de cultivo empleado es el Agar BHI (Infusión Cerebro Corazón) suplementado con 7 % de sangre de carnero des- fibrada, mas Helicobacter pylori Selective Supplement. Las placas se incuba- ron en frascos de vidrio con cierre hermético por 5 días a 37ºC, la atmosfera
microaerofilica se generó con 2 sobres de alkaseltzer (tableta efervescente de antiácidos) colocados en un frasco con 5 ml de agua estéril y 1 vela encendida.
A los cinco días de incubación de la muestra recolectada de una biopsia positiva al test urea, se observara si existe desarrollo en las placas. Si al cabo de ese tiempo no hay la presencia del crecimiento de la bacteria se esperara tres días más antes de desechar el cultivo. Se observó colonias muy pequeñas de aproximadamente 0,5 mm de diámetro, translucidas, transparentes y bri- llantes que se asemejan a gotas de roció de agua, algunas veces se presentó como una alfombra que tapiza el medio de cultivo.
Se realizó la tinción de Gram, observando en el microscopio bacilos cur- vos en forma de u, alas de gaviota o helicoidales, gram negativos.
Prueba de la catalasa. Para la realización de esta prueba se toma las colo- nias sospechosas de Helicobacter pylori en un porta objetos esparciéndolo sobre la superficie luego se le coloca una gota de peróxido de hidrogeno y si la prueba es positiva se debe observar la presencia de burbujas blancas (bur- bujeo), si la prueba es negativa no se observara la formación de burbujeo.
Prueba de la oxidasa. La prueba de la oxidasa se la realizo mediante una sus- pensión en solución fisiológica de la bacteria a la cual se le agrego un disco de oxidasa y se esperara por 5 minutos para observar el cambio de color del disco.
Prueba de la ureasa. En agar urea en pico de flauta se sembró colonias sos- pechosas de Helicobacter pylori se dejó en la estufa a 37ºC por 24 horas y se observara el cambio de color del agar.
Difusión en disco del Ácido Ursólico del Clinopodium bolivianum. Prime- ramente se realiza una suspensión bacteriana de un cultivo de 2 días de in- cubación en solución fisiológica a la escala 4 de Macfarland, se atempera las cajas con el medio agar sangre modificada para la resiembra en 3 direcciones con un angulo de 60º pasado los 10 min. Se coloca los discos de papel filtro whatman Nº 5 (diámetro de 6 mm) un disco por caja; para el control positivo se utilizó Tetraciclina (concentración 3 ug/ul volumen 10 ul), control negativo (etanol al 75% y agua estéril volumen 10ul) y Acido Ursólico (concentración
0.6 ug/ul volumen 10 ul), incubación de las cajas invertidas en jarra de anae- robiosis durante 3 días a 35-37ºC, medir los halos de inhibición con el Vernier en forma horizontal y vertical, para medir el diámetro.
Difusión en disco del aceite esencial del Clinopodium bolivianum. Se reali- zó una suspensión bacteriana de un cultivo de 2 días de incubación en solu- ción fisiológica a la escala 4 de Macfarland, se atempera las cajas con el me- dio agar sangre modificada para la resiembra en 3 direcciones con un angulo de 60º pasado los 10 min. Se coloca los discos de papel filtro whatman Nº 5 (diámetro de 6 mm) un disco por caja; para el control positivo se utilizó Tetra- ciclina (concentración 3 ug/uL volumen 10 uL), control negativo (agua estéril volumen 10 uL) y Aceite Esencial (volumen 10, 7.5, 5, 2.5, y 1 uL), incubación de las cajas invertidas en jarra de anaerobiosis durante 3 días a 35-37ºC, me- dir los halos de inhibición con el Vernier en forma horizontal y vertical, para medir el diámetro.
Tabla 1
Marco de rendimiento en porcentaje masa/ volumen del Aceite Esencial Clinopodium bolivianum.
Nº de extracciones | Peso de la planta | Aceite esencial | Rendimiento % (m/v) |
1 | 150 | 4,8 | 3,2 |
2 | 150 | 4,4 | 2,93 |
3 | 450 | 9,9 | 2,2 |
4 | 350 | 9,5 | 2,71 |
En las extracciones 1 y 2 se trabajó con hojas y tallos, de donde se obtuvo un mayor rendimiento, esto debido a que la presencia de tallos permitía ma- yor ingreso de vapor arrastrando mayor cantidad de Aceite. En comparación con las extracciones 3 y 4 que se trabajaron con solo hojas, este no presento mayor circulación de vapor es por eso que el rendimiento fue menor. En to- tal se obtuvo 28.6 ml de Aceite esencial en un total de 1100 gramos de planta.
Tabla 2
Actividad Anti-Helicobacter pylori de la Tetraciclina por la técnica de impregnación en disco.control positivocontrol negativo
Control positivo | Control negativo | |
Promedio | 40.5 | 6.18 |
I.C. 95% | 39.85 - 41.21 | 6.06 - 6.29 |
Standard Dev. | 2.26 | 0.38 |
Variación | 5.12 | 0.15 |
C.V. | 0.05 | 0.06 |
Actividad | R | S |
Promedio: Diferencia significativa frente al control **P<0.01
Actividad: S= sensible halo de inhibición mayor a 30 mm; R= resistente halo de inhibición menor a 30 mm.
Figura 1
Actividad Anti-Helicobacter pylori de la Tetraciclina.
La tabla 2 y figura 1 muestra los halos de inhibición de la tetraciclina so- bre cepas salvajes de Helicobacter pylori, el diámetro es expresado en milí- metros, también se observa los resultados del control negativo (agua estéril y etanol al 75%). La tetraciclina tiene un promedio de diámetro de halo de in- hibición de 40.5 mm, las pruebas de susceptibilidad se realizaron por tripli- cado, y para cada compuesto en estudio, siendo los resultados el promedio. Sea seleccionado la tetraciclina como control positivo debido a que es uti- lizado en la terapia alternativa para la erradicación de la Helicobacter pylo- ri cuando fracasa la terapia de primera selección, además estudios revisados demuestran tasas de prevalencia de resistencia de Helicobacter pylori de 1% para Norte América, 8% para Centro y Sur América; 5% para Asia y 2% para Europa (Ramirez, P., et al 2012). El control negativo (agua estéril y etanol al 75%) no mostro halo de inhibición en ninguno de los casos, por lo que se re- porta el diámetro del disco que es 6mm. Estadísticamente la actividad de la tetraciclina frente al control negativo es significativa con un nivel de confian- za del 99 %.
Tabla 3
Actividad Anti-Helicobacter pylori del Ácido Ursólico frente al control negativo y positivo.
control negativo | control positivo | Ac. Ursólico | |
Promedio | 6.18 | 40.53 | 31.6** |
I.C. 95% | 6.06 - 6.29 | 39.85 - 41.21 | 29.5-33.7 |
Standard Dev. | 0.38 | 2.26 | 3.79 |
Variación | 0.15 | 5.12 | 14.33 |
C.V. | 0.06 | 0.05 | 0.12 |
Actividad | S | R | S |
Promedio: Diferencia significativa frente al control **P<0.01
Actividad: S= sensible halo de inhibición mayor a 30 mm; R= resistente halo de inhibición menor a 30 mm.
Figura 2
Actividad Anti-Helicobacter pylori del Ácido Ursólico y sus modificaciones frente al control negativo.
La tabla 3 y figura 2 muestran los halos de inhibición del compuesto mayo- ritario Acido Ursólico sobre cepas salvajes de Helicobacter pylori, el diámetro es expresado en milímetros, de discos de impregnación con 10 uL [0.6 ug/uL] del compuesto en estudio. El promedio del diámetro del halo de inhibición del compuesto mayoritario Acido Ursólico es de 31.6 mm, siendo considera- do Sensible. De acuerdo a lo reportado en los anteriores trabajos Para la in- terpretación de resultados se tomó como parámetro de resistencia cuando el halo de inhibición es menor a 30 mm y como sensible cuando el halo es ma- yor a 30 mm (Ludmila Boyanova et al1999).
Tabla 4
Actividad Anti-Helicobacter pylori del Aceite Esencial frente al control negativo y control positivo.
control negativo | control positivo | aceite esencial | |
Promedio | 6.18 | 40.53 | 59.80 |
I.C. 95% | 6.06 - 6.29 | 39.85 - 41.21 | 59.49-60.11 |
Standard Dev. | 0.38 | 2.26 | 0.561 |
Variación | 0.15 | 5.12 | 0.314 |
C.V. | 0.06 | 0.05 | 0.009 |
Actividad | S | R | S |
Promedio: Diferencia significativa frente al control **P<0.01 Actividad: S= sensible halo de inhibición mayor a 30 mm; R= resistente halo de inhibición menor a 30 mm.
Figura 3
Actividad Anti-Helicobacter pylori del Aceite Esencial frente al control negativo.
La tabla 4 y figura 3 muestran los halos de inhibición del Aceite Esencial sobre cepas salvajes de Helicobacter pylori, el diámetro es expresado en milí- metros, de discos de impregnación con 10, 7.5, 5, 2.5, y 1 uL de los compues- tos en estudio.
El promedio del diámetro del halo de inhibición del Aceite Esencial es de 59.8mm, siendo considerado Sensible, la actividad de este compuesto no presenta diferencia en las muestras. Pero si realizamos una comparación con el control positivo podemos indicar que el Aceite Esencial tiene mayor activi- dad contra la bacteria a comparación con el control positivo.
Luego de realizado el trabajo se puede indicar: Que se pudo obtener el Aceite Esencial del Clinopodium bolivianum (Khoa) por arrastre de vapor, para la evaluación de la actividad. Obteniendo un rendimiento de 2.76 % (p/v) del Aceite Después de un análisis estadístico con el Ácido Ursólico, po- demos concluir que el Ácido Ursólico presenta actividad anti-Helicobacter pylori. Se determinó que los aceites esenciales (monoterpenoides) del Cli- nopodium bolivianum tiene actividad anti-Helicobacter pylori con una in- hibición completa hasta el volumen de 1 uL por disco. Después de un análi- sis estadístico con el Ácido Ursólico podemos concluir que el Ácido Ursólico presenta actividad anti-Helicobacter pylori.
Al INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN FARMACO BIOQUIMICA DE LA FCFB-
UMSA por todo el apoyo brindado.
