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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 2 (2014) 25-36
Establecimiento del sistema de generación in vitro de callos de Lupinus mutabilis sweet (tarwi)
a partir de hipocótilos
MAMANI, IRMA1 AVERANGA, KATTIA1 ESPINOZA, BORIS1 TERRAZAS, ENRIQUE1 †
CORRESPONDENCIA: BORIS ESPINOZA AEDOSP58@HOTMAIL.COM
FECHA DE RECEPCIÓN: 16 DE ABRIL DE 2014 FECHA DE ACEPTACIÓN 30 DE JULIO DE 2014
Abstract
The research for ways to improve the production of legumes, led us to study the optimum conditions for the establishment of in vitro cultivation of Lupinus mutabilis Sweet (tarwi), ancient grain legume in the Bolivian highlands, whose use is reduced by the poor technological conditions for cul- tivation, this plant being underutilized, be- ing a rich source of protein for human and animal.
For this, we worked by the genera- tion of callus from hypocotyl segments of
L. mutabilis Sw. obtained aseptically using hormonal combinations of auxin/cytoki- nin to mediating the biotransformation. The use of combinations ANA/BAP and 2,4D/ KIN proved adequate transformation with percentages greater than 60% in almost
1 Instituto de Investigaciones Fármaco-Bioquímicas, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas. Universidad Mayor de San An- drés. Av. Saavedra 2224. La Paz-Bolivia
all concentrations tested. We selected the concentration of ANA/BAP 5/0,1 mg/L for the generation of callus with a yield of 80%. But there are premature browning callus generated.
The browning and aging faced with an- tioxidant supplementation (ascorbic acid, cysteine and AgNO3) and an adsorbent (ac- tivated charcoal) in the medium, with the use of cysteine at 200 mg/L and activated charcoal at 10 g/L that prevented notably the browning of callus with percentages of 24,9% ±8,35 and 5,7±7,19 respectively. The use of antioxidants in general did not affect the transformation process but appeared to influence the development of callus.
Lupinus, Lupinus mutabilis Sw., hipocótilos, callos, leguminosas, ANA/BAP, 2,4D/
KIN, antioxidantes, adsorbentes.
El consumo de leguminosas es un complemento valioso para las dietas, en regiones donde se tiene un limitado acceso a la proteína animal. Son po- cas las poblaciones humanas en cuya dieta no estén presentes (García, 2009). Lupinus mutabilis Sweet llamado tarwi o chocho en la región andina, es una leguminosa que crece en el altiplano boliviano, no necesita mucha agua cre- ciendo bien en clima seco. En Bolivia su producción está en manos de peque- ños y medianos productores, con poca tecnificación y desconocimiento de la existencia de variedades mejoradas (Tapia, 2000).
Posee un gran valor nutritivo, con proteínas y aceites que constituyen la mitad de su peso, el tarwi es utilizado para la alimentación humana, como fruto seco o en forma de harinas, sus tallos como combustible por su gran va- lor calórico (Ortega, et al, 2010),aunque solo es consumido por un área re- ducida de la población en general (Jacobsen, 2006). Las plantas del género Lupinus son fertilizantes del suelo; al ser plantas que fijan el nitrógeno atmos- férico y mejoran su porosidad. Su uso es ideal para el cultivo rotatorio junto al cultivo de cereales (Mullin, et al, 2000).
Gracias a las investigaciones desarrolladas; en nuestros días existen dife- rentes tecnologías y sistemas, que logran: crecimiento y propagación de plan- tas con mejoras genéticas, un mejor entendimiento de la mecánica metabóli- ca y hormonal, así como la manipulación y el estudio de las interacciones de las plantas y su ambiente en condiciones controladas (Stewart, 2008).
Varios estudios acerca de la producción de cultivos in vitro y generación de plantas, sobre el género Lupinus se encuentran descritos, desde la induc- ción de tallos a partir de callos derivados de hipocótilos y embriogénesis somática a partir de cotiledones inmaduros. Junto a la implementación de técnicas de biotransformación mediada por Agrobacterium en busca de sis- temas sustentables para la producción de plantas enteras (Ewa, 1987) (Ba- baoglu, et al, 2000); muchas de las especies de leguminosas son difíciles de manipular en cultivo in vitro por ser recalcitrantes, con dificultades para la ge- neración de callos (Bahgat, et al, 2009) y con la liberación de compuestos fe- nólicos que provocan la muerte y el envejecimiento prematuro de los culti- vos (Babaoglu, 2000).
El establecimiento de nuevas técnicas y procedimientos para el mejora- miento de la producción de leguminosas tomando como base al Lupinus mu- tabilis Sweet (tarwi), nos llevó a implementar y optimizar un sistema para la generación de callos in vitro a partir de hipocótilos utilizando diferentes combinaciones hormonales de auxinas/citocininas. Establecer el sistema de mantenimiento y desarrollo suplementando los cultivos con agentes adsor- bentes (carbón activado) y agentes antioxidantes (ácido ascórbico, cisteína, AgNO3) como coadyuvantes del oscurecimiento y así evitar el envejecimien- to prematuro.
Las Semillas de Lupinus mutabilis Sweet (tarwi) fueron colectadas de la lo- calidad de Carabuco, provincia Camacho del departamento de La Paz, Bo- livia. Semillas sanas y uniformes fueron superficialmente desinfectadas con una solución de etanol al 70% v/v durante 30 segundos, seguido de una in- mersión en solución de hipoclorito de sodio al 2,5% v/v con gotas de Tween 20 (2 gotas/100mL) por 10 min y luego enjuagados 3 veces con agua destila- da estéril. Las semillas fueron secadas sobre papel filtro estéril antes de ser sembrados.
Las semillas esterilizadas son germinadas en frascos de vidrio contenien- do una base de algodón envuelto en gasa y embebidas en 20 mL de agua po- table estéril, según protocolo establecido en laboratorios del IIFB (Averanga, 2011). Los segmentos de hipocótilos de 2 a 4 mm de tamaño fueron diseccio- nados de plántulas estériles in vitro de 2 semanas de edad y utilizados como
material inicial para la biotransformación y generación de callos por variación de concentraciones hormonales auxina/citocinina.
Los hipocótilos se transfirieron a tubos de ensayo con tapa rosca (30 tu- bos/concentración/tratamiento) solución inorgánica M&S suplementado con mio-inositol 100 mg/L (Sigma), sacarosa 3% p/v. A este medio se le adiciona- ron las combinaciones hormonales descritas en la tabla 1. El pH de los me- dios fue ajustado a 5,8 y se le adicionó agar 0,8 % p/v (Sigma), la esteriliza- ción de los medios se realizó en un autoclave (All American 25X) por 15 min a una temperatura de 121 ºC. Los tubos se incubaron en una cámara climáti- ca a una temperatura de 28 ± 2ºC en condiciones de oscuridad completa. El proceso de transformación fue controlado durante 8 semanas de cultivo. Los resultados se expresaron como porcentaje de biotransformación, determina- do como el número de tubos que forman callo sobre el número de tubos to- tales por experimento.
Tabla 1
Combinaciones y concentraciones de las fitohormonas para el inicio y mantenimiento de callos a partir de hipocótilos de Lupinus mutabilis Sw. De A a D relación auxina/citosina, de E1 a E8 concentración de las fitohormonas en mg/L.
Ensayos | Tratamiento A 2,4D/BAP | Tratamiento B 2,4D/KIN | Tratamiento C ANA/BAP | Tratamiento D ANA/KIN |
E1 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 |
E2 | 0.1/5 | 0.1/5 | 0.1/5 | 0.1/5 |
E3 | 0.5/1 | 0.5/1 | 0.5/1 | 0.5/1 |
E4 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |
E5 | 1/0.5 | 1/0.5 | 1/0.5 | 1/0.5 |
E6 | 5/0.1 | 5/0.1 | 5/0.1 | 5/0.1 |
E7 | 10/0 | 10/0 | 10/0 | 10/0 |
E8 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 |
E8: experimento control sin fitorreguladores
Los experimentos que obtuvieron mayores porcentajes de biotransforma- ción y buenas características morfológicas fueron seleccionados para una se- gunda prueba, colocando de 10 a 15 segmentos de hipocótilos esta vez en cajas Petri de 12 cm de diámetro, utilizando como medio nutriente el descri- to en el screening inicial; suplementado con las combinaciones de auxinas/ citocininas descritas en la Tabla 2. Los experimentos se dejaron crecer en una cámara climática a 28ºC ±2 durante 5 semanas. Las pruebas se realizaron por triplicado, los resultados se expresaron en porcentaje de biotransformación.
Tabla 2
Combinaciones y concentraciones de fitohormonas seleccionadas después del screening inicial, para el cultivo y mantenimiento de callos de Lupinus mutabilis Sw.
Tratamiento | Combinación hormonal (mg/L) |
1 | ANA/BAP 1/0,5 |
2 | ANA/BAP 5/0,1 |
3 | 2,4D/KIN 1/1 |
4 | 2,4D/KIN 1/0,5 |
5 | Control s/hormonas |
Hipocótilos de 2 a 5 mm de tamaño se colocaron en cajas Petri con medio M&S suplementado con mio-inositol 100 mg/L, sacarosa 3% p/v y con ácido naftalenacético (ANA) 5 mg/L y 6-bencilaminopurina (BAP) 0,5 mg/ml (com- binación hormonal óptima, determinada en los experimentos desarrollados previamente), llevado a pH de 5,8 y agar 0,8% p/v (Sigma). Los medios fueron suplementados con antioxidantes (ácido ascórbico 1 mg/L, cisteína 100 mg/L, nitrato de plata 20 mg/L) y un adsorbente (carbón activado 10 g/L). Para in- crementar la firmeza del medio suplementado con carbón activado se incre- mentó la concentración de agar a 1% p/v con el carbón activado (Abdelwahd, et al, 2008). Los medios fueron llevados a un pH de 5,8 ± 0,1 y esterilizados en una autoclave (ALL AMERICAN).
Todos los experimentos se colocaron en una cámara climática a 28ºC ±2 a oscuridad completa, por un periodo de 8 semanas. Las pruebas se realiza- ron por triplicado, los resultados encontrados se encuentran expresados en términos de porcentaje de transformación y porcentaje de oscurecimiento de los callos.
La estructura morfológica, el color y textura de los callos se observó y ana- lizó con ayuda de un estéreo-microscopio NIKON NM30 con 20 aumentos, con lámpara de tungsteno.
Nosotros replicamos los experimentos por tres veces cultivando por pla- ca petri con 10 a 15 segmentos de hipocótilos. Los resultados fueron analiza- dos usando el programa SPSS 15.0 usando como herramientas el análisis de varianza unifactorial (ANOVA) con una significancia del 95%, test de Duncan para la formación de subgrupos homogéneos. Análisis no paramétrico para K muestras independientes (Kruskar Wallis) con una significancia del 95 %.
El screening inicial demostró que después de 5 semanas de crecimiento las combinaciones hormonales de auxina/citocinina de ANA/BAP y 2,4D/KIN ge- neraron mejor transformación de los hipocótilos a callos, en todas las combi- naciones de concentraciones auxina/citocinina. Un cociente alto de auxinas frente a las citocininas favoreció a la formación de callos con concentraciones de auxinas ANA y 2,4D de 1 y 5 mg/L frente a la de citocininas BAP, KIN de 1, 0,5 y 0,1 mg/L con porcentajes de transformación sobre 60% para ANA/BAP y de 57% para 2,4D/KIN. Ver figura 1.
Figura 1
Porcentaje de formación de callos en función a la concentración de auxinas/citocininas.
Resultados determinados a las 5 semanas de cultivo.
La morfología de los callos generados en los medios suplementados con ANA/BAP y 2,4D/KIN vistas en el estéreo-microscopio, tuvieron una estruc- tura compacta con crecimiento de las células en forma de racimo. Los callos tuvieron una coloración amarilla a amarillo verdosa hasta la tercera semana, oscureciéndose paulatinamente desde la tercera semana hasta tener una co- loración pardo-negruzca a la séptima semana. Ver figura 3.
Diferentes autores han descrito métodos para la generación de cultivos celulares in vitro en diferentes especies de Lupinus (Mullin, 2000) (Nadolska, 1992), en nuestro estudio no todas las combinaciones de fitorreguladores ge- neraron transformación de los hipocótilos de L. mutabilis Sw. Solo la combi- naciones de ANA/BAP y 2,4D/KIN con un cociente de auxinas mayor que de las citocininas produjeron la transformación de los hipocótilos a callos; se- mejante a los estudios de biotransformación y organogénesis realizados so-
bre cuatro especies de Lupinus: L. albus, L. luteus, L. angustifolius y L mutabi- lis (Pniewski, 2002), y semejante también el uso del 2,4D/KIN a 1/1 mg/L en la embriogénesis a partir de anteras en L. albus (Simioniuc, 2010).
La generación de callos en las combinaciones hormonales seleccionadas (ANA/BAP 5/0,1 mg/L, 1/0,5 mg/ y 2,4D/KIN 1/1 mg/L, 1/0,5 mg/L) no presen- taron diferencias durante todo el proceso de crecimiento, teniendo un perfil semejante de desarrollo durante las ocho semanas de seguimiento, llegando a un porcentaje de transformación superior al 60% para la cuarta semana. Los segmentos cultivados en medio control (sin hormonas) generaron callos, más lentamente que los medio suplementados con ANA/BAP y 2,4D/KIN, llegan- do a igualar los porcentajes de transformación a la octava semana de cultivo (ANOVA; p 0,820) Ver figura 2.
La generación de los callos en placas petri (≈ 75%) produjo rendimientos superiores a los del screening inicial (≈ 55%) realizado en tubos de ensayo, lo cual demostró la influencia existente del soporte sobre la transformación de los callos. No existieron diferencias significativas en el porcentaje de ge- neración de callos usando ANA/BAP y 2,4D/KIN durante el tiempo de culti- vo (ANOVA; p 0,820), pero si se observaron diferencias observables de colo- ración de los callos generados, siendo los cultivados en medio con ANA/BAP más compactos, de mejor aspecto, coloración amarillenta. Los callos genera- dos en 2,4D/KIN fueron más friables, de coloración amarillenta a amarillento parduzco, con ennegrecimiento prematuro de la superficie en contacto con el medio desde la cuarta semana de cultivo. Ver figura 3.
Los callos generados en el medio control son de coloración blanquecina, crecimiento en forma de roseta, compactos y con la capacidad de capturar agua en su superficie. Estos llegan a generar organogénesis de raíces y tallos cuando se mantienen en el medio durante más de 7 semanas, sin oscureci- miento ni envejecimiento. Ver figura 3.
Figura 2
Seguimiento de la generación de callos de L mutabilis Sw. de cuatro combinaciones hormonales de ANA/BAP y 2,4D/KIN durante 8 semanas de cultivo.
Figura 3
Fotografía a 20 aumentos, callos generados a partir de hipocótilos de L. mutabilis utilizando auxina/citocininas como reguladores. Izquierda; callo generado en ANA/BAP 1/0,5 mg/L. Derecha; callo generado medio sin hormonas.
Fue interesante encontrar que los cortes sin exposición a auxinas/citocini- nas generaron callos, lo cual fue reportado también en trabajos previos rea- lizados sobre biotransformación a partir de meristemos apicales, la genera- ción espontánea de callos y posterior organogénesis (Nadolska,1992). Esto demuestra que esta especie tiene este sistema de respuesta frente a daños ocurridos sobre la planta. El oscurecimiento prematuro de los callos fue evi- dente en todas las concentraciones ensayadas, según otros estudios, esto se atribuye a la presencia de compuestos que promueven la oxidación celular (Zechmann, 2008).
La utilización de antioxidantes (ácido ascórbico, cisteína y AgNO3) y un ad- sorbente (carbón activado) no afectó el proceso de biotransformación para la generación de callos no existiendo diferencias significativas entre los medios con antioxidantes, adsorbente y el medio control (M&S con hormonas) (X² 9,236; p 0,055).Ver tabla 3. Obteniéndose rendimientos semejantes al control después de 4 semanas de cultivo, demostrándonos que estos compuestos no intervienen en el proceso de biotransformación de los cortes.
El oscurecimiento de los callos, en cambio fue significativamente menor (X² 13,90; p 0,08) en el medio suplementado con carbón activado a 10g/L (5,7% ± 7,19) y con cisteína a 100 mg/L (24,9% ± 8,35), pero con un creci- miento reducido de los callos, con diámetros menores a los 10 mm. En cam- bio los callos generados en los medios suplementados con ácido ascórbico 1 mg/L y en AgNO3 a 20 mg/L tuvieron un oscurecimiento semejante al con- trol (75,60%±1,10), aunque con mayor crecimiento, con diámetros que llegan a los 20 mm después de 4 semanas. Ver tabla 3. La disminución del oscure- cimiento de los callos y diferencias en su desarrollo posterior a su biotrans- formación, demuestran que el carbón activado y la cisteína actúan paralela- mente al metabolismo celular, disminuyendo el envejecimiento prematuro en los callos.
Tabla 3
Porcentaje de biotransformación de callos de L. mutabilis Sw. en medio M&S suplementado con antioxidantes y adsorbentes.
Producto suplementado | Generación de callos (%) | Oscurecimiento sobre total de callos. (%) | Tamaño de los callos |
MS (control)* | 92,3 ± 7,70 | 75,6 ± 1,10 | ++ |
Ac Ascórbico | 75,5 ± 8,07 | 56,6 ± 11,55 | +++ |
Cisteína | 86,4 ± 5,43 | 24,9 ± 8,35 | ++ |
Nitrato de plata | 70,6 ±11,03 | 60,6 ± 13,84 | ++ |
Carbón activado | 92,3±8,89 | 5,7 ± 7,19 | + |
* MS Control: Medio M&S con ANA/BAP 5/0,1 mg/L sin antioxidantes ni adsorbentes. Codificación, diámetro de los callos: + de 2 a 5 mm ++ de 5 mm a 10mm +++ mayor a 10 mm.
El carbón activado es muy utilizado en cultivo in vitro, dependiendo del tipo de planta pueden tener una actividad inhibitoria o estimulante, y como tal es un gran adsorbente de metabolitos que pueden provocar oxidación en los cultivos (Thomas, 2008). La cisteína en cambio tiende a ser precursor de un agente antioxidante como ser el glutatión, el cual actúa evitando el enve- jecimiento celular provocado por la presencia de especies reactivas de oxí- geno, siendo parte importante en el sistema de protección ascorbato/gluta- tión (Zechmann, 2008).
El uso de antioxidantes y adsorbentes durante la transformación y mante- nimiento del cultivo de L. mutabilis Sw, fue estudiado porque su uso mejora la calidad de los cultivos y evita el envejecimiento prematuro in vitro en otras especies de leguminosas (Abdelwald 2008). Su principal utilización es dismi- nuir la mortalidad de los cultivos, evitar el oscurecimiento de los agregados celulares y reducir la probabilidad de alteraciones genéticas causadas por el subcultivo continuo y el estrés durante el proceso de adaptación (Yinghui, 2008).
Figura 4
Fotografías, callos generados a partir de hipocótilos de L. mutabilis suplementados con antioxidantes y un adsorbente a) control (ANA/BAP 1/0,5 mg/L) sin antioxidantes b)
cisteína 200 mg/L C) carbón activado 10g/L
Siendo muchas especies de leguminosas de difícil cultivo en sistemas in vitro, debido a la generación de compuesto que promueven procesos oxida- tivos así como productos fenólicos, o especies reactivas de oxigeno (H2O2). Queda comprobado con el presente estudio que el uso de antioxidantes como la cisteína y/o adsorbentes como el carbón activado pueden mejorar el proceso de biotransformación y ayudar en gran medida al mantenimiento de los cultivos en leguminosas tomando como referencia la generación de los cultivos de Lupinus mutabilis (Tarwi) y abriendo así paso a trabajos con otras leguminosas que se cultivan en gran medida en Bolivia.
Al IRD-Francia por la beca otorgada en la gestión 2008-2009, para la rea- lización de la maestría de Ciencias biológicas y Biomédicas de la UMSA. Al PhD. Enrique Terrazas por el apoyo para realizar esta investigación en el área de Biotecnología Vegetal del Instituto de Investigaciones Fármaco-Bioquími- cas de la UMSA.
