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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 2 (2014) 15-22
Diagnóstico Molecular de la Enfermedad de Chagas mediante Amplificación Isotérmica mediada por asas (LAMP)
QUISPE, SERGIO1 TORRICO, BERNARDO2 GUEVARA, PALMIRA3
FECHA DE RECEPCIÓN: 16 DE ABRIL DE 2014 FECHA DE ACEPTACIÓN 30 DE JULIO DE 2014
The monitoring of triatomino infections is a key step in the epidemiology of Chagas disease. We demonstrate the feasibility of incorporating new molecular identification tools, we obtained positive LAMP identifi- cation of infections by T. cruzi and T. range- li in haemoliph and digestive track samples preserved in filter paper. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a novel nucleic acid amplification method that am- plifies DNA with high specificity, efficien- cy and rapidity under isothermal condi- tions using a set of four specially designed primers and a DNA polymerase with strand displacement activity. We have applied a method that accelerates the LAMP reac- tion by using additional primers, termed loop primers. The LAMP method presented
Encargado Unidad de Identificación Genética, Carrera de Bioquímica, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, UMSA.
Director Carrera de Bioquímica. Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, UMSA.
Profesor Investigador Instituto de Biología Experimental, Universidad Central de Venezuela. Caracas Venezuela
here uses loop primers to achieve reaction times of less than half that of the original LAMP method, this reaction was applied to samples from Tripanosoma rangely and Tripanosoma cruzy. Since the total time of
analysis including detection is less than 1 h, this new method should facilitate genetic analysis, including genetic diagnosis in the clinical laboratory
LAMP, Isotérmica, DNA, Tripanosoma.
KEY WORDS
Las enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes en Latinoamé- rica y el Caribe, causadas por agentes patógenos como Leishmania, Trypano- soma, Mycobacterias, repercuten en la calidad de vida de las poblaciones. Las metodologías tradicionales como el cultivo, serología y la técnica de la Reac- ción en Cadena de la Polimerasa (PCR) vienen siendo utilizadas en muchos países para el diagnostico y detección de diversas enfermedades, aunque son sensibles y específicos consumen bastante tiempo y costos. Razones funda- mentales para la búsqueda de nuevas herramientas diagnosticas de amplifi- cación de ácidos nucléicos; el año 2000 los investigadores Thekisoe e Inoue en Japón desarrollaron la técnica llamada LAMP (Amplificación Isotérmica mediada por asas). Esta nueva técnica tiene las características de ser simple, rápida, especifica, sensible y de bajo costo; todo ello la faculta para ser una excelente alternativa como una prueba que pueda desarrollarse en regiones endémicas y con requerimientos básicos de infraestructura, consideramos en un futuro próximo la estandarización de esta técnica en los laboratorios de países latinoamericanos.
La incorporación de la DNA polimerasa de Basillus stearothermofilus (po- limerasa Bst) con actividad desplazante, conjuntamente con un diseño par- ticular de varios pares de iniciadores sobre la región de DNA blanco en la LAMP, son la clave de su especificidad, amplificación autogenerada y alto ren- dimiento. La polimerasa Bst ha resultado ser estable en diferentes condicio- nes de temperaturas e insensible a inhibidores frecuentemente presentes en muestras biológicas, mostrando un buen desempeño de las pruebas LAMP en muestras de diferente origen con un mínimo de procesamiento (Thekisoe e Inoue, 2011).
En el curso de una década, el análisis de estas ventajas en los procedimien- tos metodológicos ofrecidos por la LAMP, ha renovado el interés en el desa- rrollo de pruebas diagnósticas basadas en DNA como una alternativa real en el diagnóstico clínico.
En la biología de la enfermedad de Chagas, la adaptación de los vectores triatominos a los ambientes humanos, junto con la circulación de Trypanoso- ma cruzi entre estos y los animales salvajes y domésticos es el factor de ma- yor importancia para el establecimiento de la infección en humanos (1). Es necesaria la evaluación y el seguimiento de los triatominos en cuanto a su in- fección y a los cambios que conduzcan a su adaptación a ambientes huma- nos. (Quispe, 2007)
Se ha embebido en papel filtro FTA una gota de muestra, se dejo secar al menos por tres horas a temperatura ambiente. En un tubo eppendorf se in- trodujo un pequeño fragmento cortado de papel filtro con muestra. Se aña- dio 150 uL de reactivo de purificación, incubado a temperatura ambiente por 15 minutos. Se centrifugo brevemente y se descarto el sobrenadante con cui- dado. Se repitió los utlimos tres pasos nuevamente. Para lavar el sedimento se añadio 150 uL de Tampon TE. Se centrifugó y descartó el sobrenadante con cuidado. Se dejo secar a 50°C por 1 hora.
Se ha amplificado mediante la reacción isotérmica LAMP (Thekisoe, 2011), para la detección especifica de Trypanosoma cruzy y Trypanosoma rangeli, basado en los genes de RNA ribosomal 18S y los pequeños RNA nucleares.
Muestras. Las muestras correspondieron a DNA de Trypanosoma rangeli
aislado de perro y DNA de Trypanosoma rangeli aislado de Triatomino.
Foto 1
Fotografía del vector infestado. Parásitos observados de Tripanosoma rangeli
Master Mix. Se preparo una solución Master Mix con una volumen final de 25 ul por cada reacción que contenía lo siguiente: Tampón 2X, Primer Mix, enzima BST I, agua bidestilada y DNA templado aislado por método de co- lumna.
Tabla 1
Master Mix de los componentes de la reacción LAMP.
Vol. final 25ul | Concentración | Volumen de Reacción (x1) | N° de reacciones (x11) | |
REACTIVO | CONC.1 | CONC. FINAL | uL/Rxn | uL |
Tampón | 2X | 1X | 12,5 | 137,5 |
Primer Mix | 10X | 1X | 2,5 | 27,5 |
Bst I | 8 U/ul | 0,32 U/ul | 1 | 11 |
Agua MQ | - | - | 5,5 | 60,5 |
AHN | 20 mM | 120 uM | 1,5 | 16,5 |
templado | - | - | 2 | - |
Volumen final | 25 | 253 | ||
LAMP. Se trabajo con 23 ul de master mix y 2 ul de DNA de la muestra y agua bidestilada como controles del cuarto gris y cuarto blanco, a todos se les coloco 10 ul de parafina para evitar aerosoles de amplicones. En vez de in- cubarlo en baño de María, como se describe en la técnica original, se ampli- ficó en un termociclador MJ Research a temperatura estable de 63°C por 60 minutos y para terminar la reacción se aplico un shock térmico a 80°C por 5 minutos.
Revelado. Para identificar los productos de LAMP se utilizo la metodolo- gía de electroforesis en gel de agarosa al 2% y se reveló con Bromuro de Eti- dio, se visualizo en luz UV a través de la cámara de Bio-Rad.
El DNA producto de la reacción LAMP fue visualizado mediante electro- foresis en geles de agarosa como una escalera que degenera en un barrido, la cual comienza con un fragmento base generalmente mayor a cien pares de bases, cuyo tamaño lo determinan los iniciadores internos FIP/BIP. El patrón de bandas de la escalera llega a alcanzar fragmentos de más de 10 Kb, mos- trándose como un barrido o “smear” que alcanza al bolsillo del gel (Notomi, 2000).
Como se observa en la figura uno, en el carril dos (T. rangeli aislado de pe- rro) no hubo amplificación, en el carril tres (T. rangeli aislado de Triatomino) si existe amplificación del producto, en los carriles 4, 5 y 6 que contenían agua como control negativo, no se observo amplificación.
Foto 2
Corrida electroforética de Trypanosoma rangeli por metodología LAMP
Escalera de 100pb
Control+ T. rangeli Perro (Hueped)
Control + T. rangeli TRIATOMINO
Control - Agua Blanco
Control - Agua Gris
Control - Agua Blanco
En la muestra de DNA de T. rangeli aislado de perro, no se observó pro- ducto de amplificación, considerando que las posibles causas sean que el DNA de T. rangeli aislado de perro este degradado, ya que se desconocen las condiciones de conservación de la muestra, por lo que sería recomenda- ble realizar una corrida en geles de agarosa al 0.8% para evaluar el estado del mismo. Se determino que el Triatomino se encuentra infectado con Trypano- soma rangeli, por los resultados observados en la reacción LAMP, no existe reacción cruzada y/o contaminación ya que en los controles negativos utili- zados no amplificaron ningún producto inespecífico.
En la reacción de amplificación LAMP, además de la síntesis abundante del DNA blanco (>10 μg/25μL en una hora), se producen en una correlación directa, altas concentraciones del ión pirofosfato. Al reaccionar con los ca- tiones divalentes de magnesio presentes en la mezcla de reacción, se forma un precipitado de la sal de pirofosfato de magnesio detectado a simple vis- ta en el tubo de la reacción (Mori, 2001) (Figura 4). La formación del preci- pitado es directamente proporcional a la síntesis de DNA durante la amplifi- cación y permite el seguimiento en tiempo real de la reacción LAMP a través de un turbidómetro. La turbidez durante la síntesis de DNA es un fenómeno exclusivo de la reacción LAMP atribuido a su alto rendimiento, esta caracte- rística brinda una alternativa para la detección a las PAAN en tiempo real, la cual utiliza equipos de menor costo que el Real Time-PCR (RT-PCR) (Naga- mine y col., 2002).
Foto 3
Detección visual de la Formación de precipitado para Trypanosoma cruzy por metodología LAMP
En esta reaccion se ha trabajado con Azul de Hidroxinalftol a una concen- tracion final de 120 uM. Asimismo, en los carriles 2, 3 se observa amplifica- cion positiva. La muestra del triatomino amplifica, la muestra de sangre de ra- bipelao no amplifica, es probable que exista inhibicion por la hemoglobima de la sangre adherida en el papel FTA. El control Negativo del protocolo ex- traccion TE, amplificó por lo que se dede repetir nuevamente esta reaccion a nuevas condiciones de extraccion. (ver Foto 4)
Los resultados de la coloracion del Azul de Hidroxinalftol a una concentra- cion final de 120 uM, no muestran ser muy diferenciables por lo que se reco- mienda trabajar a concentraciones mayores.
Foto 4
Corrida electroforética al 2.0% de agarosa para T. cruzi.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Ladder de 1Kb
Muestra de DNA de T. cruzi de 500 parasitos/ml 3.Muestra de DNA de T. cruzi de 5 parasitos/ml 4.Muestra de DNA de T. cruzi de 0.05 parasitos/ml 5.Control negativo de Agua de Extracción 6.Muestra de Chipo 201 IBE (fijado en FTA)
Muestra de sangre de Rabipelao (fijado en FTA) 8.Control negativo de Extracción TE
9.Control Positivo. DNA de T. rangeli 10.Control Positivo. DNA de T. cruzi 11.Control negativo. Agua de Cuarto Blanco
Mediante el desarrollo de esta novedosa técnica realizada, se ha logrado aplicar el diagnostico molecular de enfermedades endémicas causadas por varios patógenos, nosotros realizamos la técnica LAMP para detectar Trypa- nosma rangeli y Trypanosma cruzi en varias muestras biológicas.
La técnica LAMP, resulto ser una nueva herramienta aplicable al fácil diag- nostico de varias enfermedades en Latinoamérica, muestran una alta especi- ficidad y sensibilidad porque se utilizaron cuatro cebadores y dos acelerado- res que reconocen el sitio blanco especifico del DNA.
La simplicidad, rapidez y bajos costos del método que utilizamos son ven- tajas fácilmente reconocibles por los investigadores por lo que se debería se- guir estandarizando para todos los microorganismos con el fin de llevar el diagnóstico a las poblaciones más susceptibles y alejadas.
La estandarización de todo método es un hecho sin precedentes y funda- mental para que cada país pueda implementarlo, el curso ha sido una mag- nífica oportunidad para los países Latinoamericanos para poder acercarnos a las nuevas herramientas diagnosticas que se han desarrollado. Por todo esto enaltecemos y felicitamos a todo el grupo organizador y la excelente ponen- cia de los Profesores Invitados, asimismo a los diferentes invitados especiales de los pueblos de Latinoamérica, Se han creado nuevos lazos de integración de conocimientos y el enfoque hacia la lucha por la salud pública.
El trabajo experimental fue Financiado por:
United Nations University. BIOLAC
Biotechnology Programme for Latin America and the Caribbean Programa de Biotecnología para América Latina y el Caribe
Thekisoe, O. Bazie, R, Coronel, A., Sugimo- Kiatpathomchai, W., Jaroenram, W., Arunrut,