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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 1 (2013) 29-36
ESPINOZA, BORIS, A.1 SALAMANCA, EFRAÍN, A.1 FLORES, NINOSKA, A.1
CORRESPONDENCIA: BORIS ESPINOZA AEDOSP58@HOTMAIL.COM.
Fraccionamiento bioguiado de las hojas de Piper hispidum Swartz
Abstract
Fractionation of ethanol extract of leaves of Piper hispidum Swartz were iso- lated and identified four products previ- ously founds in bibliography, but first re- ported in this species: P1 (5-hydroxy-7, 4
‘-dimetoxiflavanone), P2 (caryophyllene ox- ide), P3 (sphatulenol) and P4 (trans-phytol). Their structures were elucidated on the ba- sis of data from 1H and 13C NMR, including heteronuclear correlations HSQC, HMBC and comparison with the literature found. Leishmanicidal activity of the compounds was tested against two strains of Leishma- nia: L. amazonensis, L. braziliensis. The re- sults showed that flavanone (5-hydroxy-7, 4’-dimetoxiflavanona) with IC50= 14.1 and
13.1 μg/mL, and terpene (caryophyllene ox- ide) with IC50 = 36.7 and 26.8 μg/mL were
1 Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas. Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas. Universidad Mayor de San Andrés. La Paz, Bolivia.
moderately active compared with Ampho- tericin B IC50 = 0.21 and 0.09 μg/mL for both strains.
Piper hispidum Sw, flavanona, oxido de cariofileno, espatulenol, trans-fitol, leishmanicida.
Piper hispidum Sw, flavanone, caryophyllene oxide, sphatulenol, trans-phytol, leishmanicide.
Piper hispidum Swartz pertenece a la familia de las Piperaceae, género Pi- per. Es un arbusto que crece en zonas tropicales, como pequeñas manchas o agrupaciones en la selva, crece en zonas con alta precipitación fluvial a una altura menor a 200 m (Parthasarathy, 2006). Por sus características morfológi- cas, esta especie se ha diferenciado en más de 6 variedades, distribuidas am- pliamente desde las Antillas y Centro América hasta los bosques tropicales de Sud América (Erika, et al, 2008).
El género Piper ha demostrado tener una gran variedad de especies con metabolitos secundarios interesantes, con diversas actividades y utilizados extensamente de forma tradicional. Estos se encuentran en diferentes partes de la planta: hojas, tallos, inflorescencias y raíces (Parmar, 1997). Estudios fito- químicos reportados de P. hispidum SW y P. hispidum H.B.K., han demostrado el aislamiento de metabolitos como: amidas, aceites esenciales, flavonoides entre otros, con actividad antifúngica (Alecio, 1998), antibacteriana (Delgado, 2007) y leishmanicida respectivamente (Hermoso, 2003).
En la medicina tradicional, las diferentes variedades existentes de Piper hispidum se usan para el tratamiento de diversas afecciones como: los esca- lofríos, antiséptico, contra el dolor de estómago (Mitchell, 2006) y tratamien- to de la úlcera gástrica (Goel, 2002). Según la farmacopea tradicional “Tacana. Conozcan nuestras árboles, nuestras hierbas” (1999) los pueblos Tacana, Mo- setene y Chimane usan la infusión de las hojas para el tratamiento de diver- sas parasitosis. Sé considera que solo el 10% de las especies conocidas mun- dialmente pertenecientes a esta familia han sido químicamente investigadas (Kato, 2007).
La búsqueda de agentes antiparasitarios para enfermedades consideradas huérfanas por la OMS-OPS, abren paso a la realización de estudios exhaus- tivos para el aislamiento y posterior identificación de los metabolitos secun- darios presentes en P. hispidum, con posible actividad frente a parásitos de Leishmania y Plasmodium. En la presente investigación se han aislado 4 com- puestos, encontrados en otras especies pertenecientes a la familia Pipera- ceae, pero reportadas por primera vez en P. hispidum Sw.
Los espectros de RMN1Hy RMN13C se obtuvieron utilizando un espectró- metro BRUKER de 300 MHz. Los valores del desplazamiento químico (d) fue- ron reportados en ppm y las constantes de acoplamiento (J) están expresadas en Hz. Los productos fueron disueltos en CDCl3.
La cromatografía líquida al vacío (CLV) y las cromatografías en columna
(CC) se realizaron en gel de sílice fino (0,063; 0,200 mm de diámetro). Para la cromatografía en capa fina (CCF) se utilizaron placas cromatográficas con base de aluminio de 0,25 mm de espesor de gel de sílice tipo G, con indica- dor de fluorescencia a 254 nm, Whatman AL-SIL G/UV254.
Las hojas de Piper hispidum Swartz (GB 1925), fueron colectadas en la provincia Abel Iturralde (13°46’S, 68°12’ W) del departamento de La Paz, a una altura de 380 m.s.n.m en el año 2008. Las hojas fueron secadas y pesadas (500 g), se maceraron con etanol al 96% durante 3 días. El macerado etanólico se filtró, y concentró en rotaevaporador (Laborota 4000) acoplado a baja pre- sión, a una temperatura de 40ºC (90 RPM) obteniendo así el extracto crudo.
El extracto crudo se disolvió en una mezcla de CH2Cl2/EtOH (1:1), las dos fases formadas se separaron, filtraron y concentraron en rotaevaporador ob- teniéndose dos extractos, un extracto etanólico (28 g) y un extracto orgánico (18,4 g). La actividad leishmanicida de ambos extractos fue evaluado, siendo el extracto orgánico activo frente a 2 cepas de Leishmania. El extracto orgá- nico fue sujeto a un fraccionamiento por CLV en sílica gel, utilizando mez- clas de éter de petróleo/ CH2Cl2 y CH2Cl2/MeOH obteniéndose nueve frac- ciones (F1-F9).
La fracción F5 (102.2 mg) se separó por CC con un sistema de elusión de Éter de petróleo/CH2Cl2 y CH2Cl2/MeOH en orden creciente de polaridad, ob- teniéndose 18 fracciones. Después de realizar el análisis por CCF se reunieron estas en 6 fracciones (F5.1- F5.6). La fracción F5.3 (17,6 mg) fue purificada por cromatografía en capa fina utilizando como sistema de elusión CH2Cl2/MeOH (100 ml:10 gotas), aislándose el producto P1 denominado como 5-hidroxi-7,4’- dimetoxiflavanona.
La fracción F4 (202,0 mg) fue separada por cromatografía en columna con un sistema de elusión de Éter de petróleo/CH2Cl2 y CH2Cl2/MeOH en orden creciente de polaridad, obteniendo 20 fracciones. Después de un análisis por CCF estas se reunieron en 8 fracciones (F4.1- F4.8). La fracción F4.4 (33.4 mg) fue purificada por cromatografía en capa preparativa utilizando un sistema de elusión CH2Cl2/Me2CO (97:3), aislándose el producto P2 conocido como oxido de cariofileno.
La fracción F2 (74,2 mg) se separó por CC con un sistema de elución de Éter de petróleo/CH2Cl2 en orden creciente de polaridad, obteniéndose 10
fracciones. Realizado el análisis de los componentes por CCF estas se reunie- ron en 3 fracciones (F2.1- F2.3). Las tres fracciones se purificaron por croma- tografía en columna utilizando un sistema de elusión Hexano/Et2O (85:15). De la fracción F2.1 se han aislado los productos P3 esfatulenol y P4 transfitol
La actividad leishmanicida in vitro fue evaluada frente a formas promasti- gotes de Leishmania braziliensis clon1 (M2904 C192 RJA) y Leishmania ama- zonensis Lma (MHOM/BR/76/LTB-012). Los parásitos crecieron a 28ºC en cul- tivo estacionario que fueron llevados a 1x104/100μL/pocillo, en microplacas de 96 pocillos en medio para Leishmania RPMI 1640.
Las muestras y las drogas estándar se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO). Las cepas fueron cultivadas en medio Schneider suplementado al 5% con suero bobino fetal inactivo (56° por 30 minutos). Los parásitos en fase de crecimiento fueron distribuidos en micro placas de 96 pocillos a una con- centración de 1 x 106 parásitos/mL y cada pozo es tratado con diferentes con- centraciones de los extractos y sus fracciones durante 72 horas.
La viabilidad de los parásitos se determinó por el método colorimétrico XTT-PMS. En cada pocillo con parásitos se le añadió 50 μL de reactivo XTT- PMS y se incubó durante 4 horas a 37°C. Después las placas fueron leídas en un lector ELISA a una longitud de onda de 450 nm. Los resultados de activi- dad leishmanicida son expresados en valores de CI50 (concentración de la droga que inhibe el 50% del desarrollo del parásito), obtenido graficando la absorbancia en función de las concentraciones de parásitos viables. Las prue- bas fueron realizadas por triplicado, el análisis de los datos se realizó median- te Microsoft Excel 2000.
El fraccionamiento-bioguiado del extracto etanólico (CI50= 41.1μg/L, 37.7μg/mL) de las hojas de P. hispidum Sw fue realizado sobre 2 cepas de Leishmania: L. amazonensis y L. braziliensis. La actividad leishmanicida fue encontrada en la fase orgánica (CI50= 83.6μg/L, 81 μg/L). Del sub-fracciona- miento de la fase orgánica se han obtenido 9 sub-fracciones (F1-F9), de las cuales se han aislado e identificado cuatro productos: el producto P1(1) de la fracción F5, el producto P2(2) de la fracción F4 con actividades moderadas frente ambas cepas. Los productos P3 (3) y P4 (4) de la fracción F2.
El compuesto P1 presentó una fórmula molecular C17H16O6 datos obteni- dos por EMAR. Su espectro RMN1H (Tabla 1) presentó señales de un sistema AX2 con una señal a δ 5.39 (dd, J= 3.0, 13 Hz) asignado a un protón oximetí- nico en C2, acoplado a dos protones δ 2.81 (dd, J= 3.0, 17.1 Hz) y δ 3.13 (dd, J= 3.0, 17.1 Hz) asignables a un metileno H-3. Así mismo, se observaron dos singuletes a δ 3.83 y δ 3.86 asignables a dos grupos metoxilo; señales para seis protones aromáticos a δ 6.98 (dd, J= 2.1 Hz), 6.97 (dd, J=2.1 Hz) y 7.39 (dd, J=2.85 Hz) que integran a un protón cada uno y que conforman un ani- llo aromático con regiosustitución para y dos dobletes a δ 6.07(J= 2.3 Hz) y
6.09 (J= 2.3 Hz) que integran a un protón cada uno correspondientes al otro
anillo aromático, indicando una sustitución 1, 3 sobre dicho anillo. Un singu- lete para protón fenólico a δ 12.05, intercambiable con agua deuterada, este último característico de un grupo fenólico en disposición sin planar a un gru- po carbonilo.
El espectro RMN 13C (tabla 1) mostró señales para 17 átomos de carbono, asignados como dos carbonos metoxílicos a δ 55.37 y 55.67, un carbono meti- lénico, siete carbonos metínicos y siete carbonos cuaternarios, destacándose la señal de un carbonilo a δ 196.0 (C-4), un carbono oximetínico a δ 79.0 (C-2) y un carbono metilénico a δ 43.2 (C-3). El análisis del conjunto de señales por los experimentos de HSQC y HMBC confirmaron la presencia en la molécula de dos anillos aromáticos y un anillo central correspondiente a una estructu- ra C6-C3-C6, característica de una flavanona.
La localización de los grupos metoxilos en la molécula se determinó me- diante HSQC y HMBC (Figura 1), destacando las correlaciones protón-carbo- no de uno de los metoxilo a δH 3.86 y los protones a δH 7.46 (H-2’, H-6’) con un carbono cuaternario a δC 160.07 (C-4’), los protones a δH 6.98 (H-2’, H-6’) con el carbono a δC 130.40 (C-1’); y el otro metoxilo a δH 3.82 con el carbo- no a δC 167.97 (C-7). Nos ayudó a establecer la regiosustitución en cada uno de los anillos en la molécula. Estos datos y la comparación con los datos de la bibliografía química de compuestos relacionados, nos permitieron estable- cer la estructura de P1 como 5-hidroxi-7,4’-dimetoxiflavanona (Erika, 2006)
Figura 1
Correlaciones de RMN 1H-13C del experimento (HMBC) para los compuestos P1 y P2
El compuesto P2 presentó la fórmula molecular C15H24O por EMAR. El es- pectro de RMN 1H (Tabla 1) presenta señales claras para 3 grupos metilo a δ
0.99 (s, Me-12), 1.01 (s, Me-13) y 1.2 (s, Me-15), dos singuletes de protones vi- nílicos a δ 4.86 (s, H14a) y 4.98 (s, H14b). En los espectros RMN 13C (Tabla 1) se observaron señales de 15 carbonos, con la presencia de tres grupos me- tilo, seis metilenos, tres metinos y tres carbonos cuaternarios; destacándose las señales del metileno geminal a δ 112.73 (C-14), y el carbono cuaternario vinílico a δ 151.84 (C-4).
Tabla 1
Datos de 1H – 13C RMN (δ, CDCl3) de los compuestos P1 y P2
(P1) 5-hidroxi-7,4’-dimetoxiflavanona | ||
Posición | ||
1 | δH | δC |
2 | 5.39 d | 79.01 |
3ª | 2.81 dd | 43.21 |
3b | 3.13 dd | |
4 | 196.02 | |
5 | 164.15 | |
6 | 6.09 d | 95.09 |
7 | 167.98 | |
8 | 6.07 d | 94.23 |
1’ | 130.40 | |
2’ | 7.46 d | 127.73 |
3’ | 6.98 d | 114.24 |
4’ | 160,07 | |
5’ | 6.98 d | 114.73 |
6’ | 7.46 d | 127.73 |
OCH3 | 3.83 s | 55.67 |
OCH3’ | 3.86 s | 55.36 |
(P2) Oxido de cariofileno | ||
Posición | ||
1 | δH | δC |
2.89 dd | 63.74 | |
2 | 2.12 m | 39.16 |
3 | 2.30 m | 30.18 |
4 | ||
5 | 2.62 m | 48.72 |
6 | 1.69 m | 50.78 |
7 | 1.30 m | 29.81 |
8 | 1.42 m | 39.76 |
9 | ||
10 | 1.64 m | 27.21 |
11 | ||
12 | 0.99 s | 29.88 |
13 | 1.01 s | 21.62 |
14a | 4.86 s | 112.74 |
14b | 4.98 s | |
15 | 1.21s | 16.98 |
* Los datos se basaron en los experimentos DEPT, HSQC y HMBC
De acuerdo a los experimentos HSQC y HMBC, las relaciones más carac- terísticas en la molécula están dadas por la correlación de los protones viní- licos δH 4.86 (H-14a) y δH 4.98 (H-14b) con los carbonos δC 30.18 (C-3) y δC
50.79 (C-5). El protón δH 2.88 (H-1) con el carbono δC 30.18 (C-3). El protón δH (H-7) con el carbono de δC 59.82 (C-9). La correlación entre los protones de los grupos metilo δH 0.99 (Me-12) y el metileno δH 1.01 (Me-13) con el carbono cíclico a δC 50.79 (C-6) y los protones del grupo metilo δH 1.21 (Me-
15) con los carbonos cíclicos δC 63.74 (C-1) y δC 39.77(C-8).Lo cual nos con- firma la estructura cíclica de la molécula formando un oxido con dos anillos de nueve y cuatro carbonos, la existencia de un vinilo lateral a la cadena, 2 grupos metilo sobre el carbono C-11 y un grupo metilo sobre el carbono C9, nos ayudó a establecer la estructura del producto P2 como óxido de cariofi- leno (Torquilho, 1999).
Los espectros RMN 1H y RMN 13C de los compuestos P3 y P4 son semejan- tes a los reportados en la literatura, asignables al tran-fitol (P3) (Orjala, 1993) y al esfatulenol (P4) (Fuyihiko, 1985), encontrándose en otras especies de la familia Piperaceae como P. aduncum, P. rusby (Flores, 2007), P. frimbiolatum y
P. obliquum (Mundina, 1998).
Tabla 2
Actividad leishmanicida de los extractos y metabolitos aislados P. hispidum Swartz
CI50 μg/mL | ||
L. amazonensis | L. braziliensis | |
Extracto crudo etanólico | 41.1 | 37.7 |
Fracción acuosa | > 100 | > 100 |
Fracción diclorometano | 83.6 | 81 |
P1 | 31.5 | 37.8 |
P2 | 36.7 | 26.8 |
P3 | 38.8 | 53.7 |
P4 | 58.8 | 43.9 |
Patrón: Anfotericina B (CI50 = 0.8 μg/mL; 0.2μg/mL respectivamente)
Los compuestos aislados de P. hispidum fueron analizados para deter- minar la actividad leishmanicida (Tabla 2). Los resultados de la evaluación leishmanicida sobre cultivos de promastigotes in vitro de L. braziliensis y L. amazonensis mostraron que el producto P1 (flavanona) presentó la mejor ac- tividad frente a las dos cepas con CI5014.1 y 13.1 μg/mL respectivamente. Los productos P2 (óxido de cariofileno), P3 (trans-fitol) y P4 (espatulenol) fueron moderadamente activos, los valores de CI50 se presentan en la tabla 2. Como control se utilizó la anfotericina B con CI500.8 y 0.2 μL. Las actividades de los compuestos P3 y P4 son semejantes a los obtenidos en el estudio sobre la ac- tividad leishmanicida en P. rusby (Flores, 2007).
J=17.1 Hz, H-3b), 3.83 (3H, s, OMe), 3.86 (3H, s, OMe), 5.39 (1H, dd,J=3.0yJ=13
Hz, H- 2),6.07 (1H, d, J=2.31 Hz,H-8),6.09 (1H, d, J=2.29 Hz, H-6), 6.98 (2H, d,
6), 103.43 (C10), 114.24 (C-3’, C-5’), 127.73 (C-2’, C-6’), 130.40 (C-1’), 160,07 (C4’),
162.91 (C9), 164.5 (C-5), 167.9 (C-7), 196.0 (C-4).
Me-15), 1.30 (2H, m, H-7), 1.64 (2H, m, H-10), 1.42 (2H, m, H-8), 1.69 (1H, m,
H-6), 2.12 (2H, m, H-2), 2.30 (2H, m, H-3), 2.62(1H, m, H-5), 2.89 (1H, dd, J=
(Me-15), 21.62 (Me-13), 27.21 (C-10), 29.81 (C-7), 29.88(Me-12), 30.18 (C-3),
34.01 (C-11), 39.16 (C-2), 39.76 (C-8), 48.72 (C-5), 50.78 (C-6),59.82 (C-9), 63.74
(C-1), 112.73 (C-14), 151.84 (C-4).
BME, agradece a la cooperación IRD-FRANCIA, por la beca otorgada para la realización de la Maestría en Ciencias Biológicas y Biomédicas ges- tión 2008-2010. ENFQ agradece a la cooperación ASDI-SAREC por el finan- ciamiento del proyecto con fondos concursables ASDI/TB-BRC 2009 y 2010.
