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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 1 (2013) 11-18
Actividad antiprotozoaria in vitro de alcaloides totales de corteza (CAT) de Galipea longiflora Krause Kallunki (evanta) sobre trofozoitos de 2 cepas de Acanthamoeba
SALAMANCA CAPUSIRI, EFRAIN1 FLORES, NINOSKA1
TICONA HUALLPARA, JUAN CARLOS1 MORALES JACOB, LORENZO2 CABRERA-SERRA, MARIA GABRIELA2
PIÑERO, JOSE2 UDAETA, ENRIQUE1 CHUQUI, ROGELIO3
GIMÉNEZ, TURBA ALBERTO1
Galipea longiflora (Evanta), plan-
Abstract
Galipea longiflora (Evanta), plant used in Amazonian traditional medicine, has been shown in previous studies to pres- ent antiparasitic activity against Leishma- nia, Trypanosoma cruzi, Plasmodium, as well as immune regulatory activity. The present work shows the in vitro antipara- sitic activity of the total bark alkaloids, ex- tracted from Evanta, against trophozoites of 2 strains of Acanthamoeba: Acanthamoeba castellani Neff and Acanthamoeba polyfaga MN7, both present an IC50 of 12.01 ± 0.67 μg/mL and 27.34 ± 2, 65μg/mL, respective- ly. Using the fluorometric method, with Al- amar Blue, and these results very interest- ing because are near ranges of inhibition showed by chlorhexidine and PHMB, topi-
Unidad Parasitología, Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés. La Paz-Bolivia.
Unidad de Parasitología, Instituto de Enfermedades Tropicales y Salud Publica, Facultad de Farmacia, Universidad de la Laguna. Tene- rife-España.
Comunidad Santa Rosa de Maravilla (CIPTA)
cal antiseptics with antiprotozoal activi-
ty, used for treatment of keratitis produced by species of Acanthamoeba, and because shows IC50 very close to phospholipid de- rivatives such as Miltefosine, octadecyl-PC, PC-Elaidil, reported and tested on the same of Acanthamoeba species. Thus, the present work constitutes the first report of activity against the Amoebidae family by this plant species which scientifically supports the traditional use as Amebicide of Evanta bark constituting a promising alternative against diseases caused by free-living amoebae.
KEY WORDS
Acanthamoeba, Evanta, Galipea longiflora, Alamar Blue, IC50.
Se conoce a las amebas, por lo general, como organismos de forma cam- biante, dentro de ellas, hay un grupo, el de las amebas de vida libre, que has- ta hace unas décadas, no parecía interesar más que a los especialistas más es- trictos y en la actualidad, se sabe que algunos de sus representantes, como son las especies de Acanthamoeba, afectan al hombre y pueden causarle gra- ves patologías (Ortega, 2002).
Las amebas de vida libre del género Acanthamoeba se han aislado en una amplia variedad de hábitat como ser piscinas, conductos de calefacción y de ventilación, suelos, agua mineral embotellada, aire, balnearios, vegetales, se- dimentos marinos, lodos procedentes de aguas residuales. Además se han identificado en unidades de diálisis, polvo en suspensión, medios de cultivo de bacterias o células, lentes de contacto donde la mayoría de los casos re- portados están asociados a una incorrecta limpieza de las lentes de contac- to, empleando soluciones salinas de producción hogareña o el agua de red clorada para el enjuague de las mismas (Morales, 2006; Radford et al., 2002), sus estuches y soluciones para el cuidado de las mismas e, incluso en dispo- sitivos intrauterinos (DIU), haciendo que su contacto con el hombre sea un hecho aparentemente común. Se ha observado que, hasta un 80% de la po- blación, posee anticuerpos específicos frente a Acanthamoeba, siendo aisla- das de la nariz y garganta de individuos asintomáticos. (Ortega, 2002; Loren- zo-Morales et al.,2005).
Las patologías que provoca Acanthamoeba están relacionadas con los teji- dos que son capaces de colonizar. Pueden invadir el sistema nervioso central, provocando una meningitis denominada Encefalitis Granulomatosa Amebia- na (EGA). También pueden encontrarse formando ulceraciones en la piel o in- vadiendo la córnea, provocando queratitis oculares (Ortega, 2002) que si bien es una patología poco común, en los últimos años ha aumentado su frecuen- cia asociada, sin duda, al uso de lentes de contacto, especialmente las de tipo blando.(Navarro, 1998). En pacientes inmunodeprimidos, se han descrito ca- sos en los que provocan infecciones diseminadas (Ortega, 2002).
Las actuales medidas terapéuticas para la queratitis producida por Acanthamoeba incluyen una combinación de diaminas y biguanidínas dentro de estas últimas las más activas son la clorhexidina presentando un rango de inhibición in vitro de 0.49-1.9μg/mL y polihexametilenbiguanidina (PHMB) de 0.49-3.9μg/mL (Elder, 1994), siendo tratamientos de larga duración (Navarro, et al 1998; Elder, et al 1994; Seal, 2003) y en muchos casos poco eficases contra las etapas enquistadas del protozoario provocando así infecciones residuales incluso luego del tratamiento (Seal, 2003). No se ha establecido ningún trata- miento eficaz contra la EGA (McBride, et al 2007; McBride, et al 2005) por lo que nace la necesidad y la búsqueda de nuevos agentes antiparasitarios como lo muestran los derivados fosfolipídicos (Miltefosina-Hexadecil-PC, Octade- cil-PC, Elaidil-PC, Erucyl-PC, Edelfosina, Perifosina, etc) usados originalmente como anticancerígenos y que recientemente resultaron ser muy activos fren- te a formas parasitarias de Leishmania, Tripanosoma cruzi, Entamoeba histo- lytica y especies de Acanthamoeba. (McBride, et al 2005; Papagiannaros, et al 2005; Cabrera-Serra,2007).
La especie medicinal Galipea longiflora es utilizada por las etnias amazó- nicas: Tacana, Mosetene, Chimanes como antiparasitario (Bourdy, 1999), estu- dios in vivo e in vitro han demostrado está actividad antiparasitaria frente a di- ferentes formas y cepas parasitarias de Leishmania (L.donovani, L.braziliensis, L.chagasi, L.amazonensis) (Fournet et al 1993; Caron et al 1993; Fournet et al 1994-1996) como también se ha demostrado su actividad frente a Tripanosoma cruzi (Nakayama, 2001), como su actividad frente a Plasmodium vinckei(Gantier, 1996). Mediante estudios en modelo animal se determino la toxicidad aguda y subcrónica como los parámetros farmacocinéticos para el extracto crudo de esta especie vegetal (Giménez, 2005), y se estableció un sistema de cultivo ce- lular semicontinuo in vitro para células de evanta (Paz, 2007). Recientes es- tudios muestran el efecto del extracto de alcaloides de evanta sobre la pro- ducción de TNF y IFN-γ (Calla-Carrasco, 2007). Dada la importancia de está especie vegetal el I.I.F.B viene desarrollando formulaciones farmacéuticas tó- picas (pomada) y sistémicas (jarabe) en base a los alcaloides totales de corteza de evanta para el tratamiento de pacientes con leishmaniasis cutanea. Basados en el conocimiento de la medicina tradicional y al amplio estudio científico en base a está especie vegetal es que el presente trabajo pretende demostrar de forma científica el uso tradicional de está especie vegetal como amebicida y así ampliar la actividad antiparasitaria de evanta, demostrando la actividad in vitro de CAT frente a 2 cepas de Acanthamoeba (castellani – polyfaga), responsables de una serie de patologías en el hombre.
Dos cepas fueron utilizadas para este estudio, Acanthamoeba castella- ni Neff (ATCC30010) cepa tipificada por American Type Culture Collection y un aislado clínico (MN-7) que fue identificado previamente como Acantha- moeba polyphaga.
Las cepas se mantuvieron en crecimiento en medio PYG (0.75 % peptone proteosa (p/v), 0.75 % extracto de lavadura (p/v)) al cual se añadió 1.5% de glucosa (p/v), con 50μg gentamicina (Roche Diagnostics) previamente descri- to por Morales (2006).
Foto 1
Acanthamoeba castellani Neff –Cultivo In vitro Medio PYG
El material vegetal (corteza de evanta) seco finamente molido fue mace- rado por 3 días en CH2Cl2 (10L x 3 veces), en percoladores cónicos de acero inoxidable (diámetro inferior 22cm y diámetro superior 42 x 74cm de alto). El extracto fue filtrado y concentrado a 40oC y secado con una bomba de alto vacío hasta peso constante.
El extracto crudo (50g) fue disuelto en CH2Cl2 (100mL) y sometido a lavados sucesivos con HCl 1N (100mL x 3 veces c/u por 30 minutos sobre agitador mag- nético). Los lavados ácidos fueron controlados con un espectrofotómetro UV, combinados y llevados a precipitación completa con NaOH 2N (150mL). El sólido formado fue extraído con CH2Cl2 deshidratado con NaSO4, filtrada, evapora- da al vacío y secada con una bomba de alto vacío hasta tener un peso constante.
Se tomaron alícuotas de las cajas de cultivos madre de ambas cepas de Acanthamoeba a quienes se determino su población mediante un contador automático.
Ambas cepas de Acanthamoebas fueron sembradas por duplicado en pla- cas de 96 pozos, sembrando 50μL de una solución de 8x103 células/mL, por lo que se tuvo 400 amebas en cada pozo. Se dejo aproximadamente 15 minu- tos en reposo la placa para que las amebas puedan adherirse al posillo, esto fue comprobado bajo la observación en un microscopio invertido. (Axiovert 25- Zeizz)
Luego se añadió 50 μL de diferentes concentraciones CAT (100μg/mL, 50μg/mL, 25μg/mL, 12,5μg/mL, 6.25μg/mL) disueltas en medio PYG obtenidas a partir de una solución madre (2mg de CAT/200 μL de DMSO), donde la con- centración final de DMSO fue ≤ al 1%. Finalmente se añadió el reactivo de en- sayo Fluorométrico Alamar Blue (Biosource, Europe, Nivelles, Belgium) a cada uno de los pozos de placa en una cantidad igual al 10% del volumen final, la placa fue incubada por 120 horas a 28oC con agitación leve. Se realizo la lec- tura de las placas en un lector de microplacas modelo 680 (Biorad, Hercules, CA) usando un filtro de excitación de 570nm y un filtro de emisión de 630nm. El porcentaje de inhibición y el 50% de la concentración inhibitoria (IC50) fue calculado por análisis de regresión lineal usando el programa informático
sigma Plot 0.9. (Systat Software Inc).
La queratitis producida por especies de Acanthamoeba es una afección poco frecuente pero potencialmente grave, las actuales medidas terapéuticas para la queratitis consiste el uso tópico de un conjunto de antimicrobianos, sin embargo muchas veces estos tratamientos no son eficaces contra etapas enquistadas del protozoario y peor aun no existe un tratamiento eficaz frente a la EGA, ante la necesidad de nuevos agentes antiparasitarios en los últimos años se viene realizando estudios de actividad antiparasitaria de derivados fosfolipídicos (Miltefosina-Hexadecil-PC, Octadecil-PC, Elaidil-PC, Erucyl- PC, Edelfosina etc) que fueron inicialmente diseñados como anticanceríge- nos que a su vez mostraron una excelente actividad antiparasitaria frente a formas parasitarias de Leishmania, Trypanosoma cruzi, Entamoeba histolyti- ca y especies de Acanthamoeba. Es así que los resultados mostrados por CAT son relevantemente buenos en relación a los rangos de inhibición de la po- lihexametilenbiguanida-PHMB (0.49-3.9μg/mL) y la clorhexidina (0.49-1.9μg/ mL) antisépticos tópicos más eficaces utilizados en queratitis por Acantha- moeba reportados por Elder et.al. (1994), mostrando también una estrecha relación a los IC50 de Miltefosina reportados en estudios previos por Mc- Bride et.al. (2007-2005) como el más prometedor derivado fosfolipidico para el tratamiento de Acanthamoebiasis ensayado sobre las mismas especies de Acanthamoebas, mostrando IC50 de 2.38 y 9.52 μg/mL frente a A.Castellani y A polyfaga repectivamente, coincidiendo estos resultados a la sensibilidad que presenta A castellani a CAT en relación a A.polyfaga.
Figura 1
Actividad antiparasitaria in vitro de CAT frente a trofozoitos de 2 cepas de Acanthamoeba (Neff-MN7) Método colorimétrico Alamar Blue
Tabla 1
IC50 de CAT in vitro sobre trofozoitos de 2 cepas de Acanthamoeba Método colorimétrico Alamar Blue incubados a 28oC por 120 horas
Cepa | Acanthamoeba castellani Neff | Acanthamoeba polyfaga MN7 |
IC50 μg/mL | 12.01±2,6 | 27.34±0,6 |
Es conocido el uso tradicional de esta especie vegetal por las etnias Taca- nas, Mosetenes y Chimanes de Bolivia, quienes recomiendan usar pedazos de corteza molida de evanta sancochada en tres litro de agua en casos de diarrea con sangre (Bourdy et al 1999), es así y debido a que Acanthamoeba perte- nece al mismo orden Amoebida en el cual se encuentra Entamoeba histolyti- ca que es la responsable de una serie de diarreas en nuestro país (Mollinedo, 2006), que el presente trabajo muestra de una forma científica la validación del uso tradicional de esta planta (Evanta) como amebicida.
El presente trabajo muestra de una forma científica el uso tradicional de corteza de evanta como amebicída debido a los resultados de IC50 encon- trados de CAT frente a trofozoitos de 2 cepas de Acanthamoeba como son Acanthamoeba castellani Neff y Acanthamoeba polyfaga MN7 los que pre- sentan IC50 de 12.01±0,67μg/mL y 27.34±2,65μg/mL, respectivamente me- diante el método colorimétrico Alamar Blue, resultados realmente muy inte- resantes en relación con los rangos de inhibición de los antisépticos tópicos utilizados en queratitis por Acanthamoeba.
Si bien es cierto que los derivados fosfolipidicos responden muy bien frente a protozoarios de la familia tripanosomatidae, edelfosina no presenta actividad frente a Acanthamoeba lo que pudiera indicar que Acanthamoeba
seria susceptible a un rango más limitado de derivados fosfolipidicos, es así que CAT puede llegar a resultar una alternativa prometedora frente a pato- logías producidas por amebas de vida libre, sin embargo un estudio más de- tallado quizá por separado de los alcaloides de evanta frente a las diferentes formas del parasito (trofozoitos- quistes) creemos que es importante.
Al Proyecto UMSA-IDH-2012 “Desparasitación de niños en escuelas rura- les II”. A la agencia AECI, por los proyectos PCI con la Universidad de La Lagu- na, al IRD Francia por beca de Maestría (SCE), a la Fundación AvH/Stiftung y la OEA, por la donación de equipos. Al CIPTA y la comunidad de Santa Rosa de Maravilla, por la colecta de la especie medicinal.
