REVISTA CON-CIENCIA 2023, Vol. 11, No 2

DOI: https://doi.org/10.53287/mbmi5442pt35v

Resumen

Introduction: Alrededor de 3700 millones

menores de 50 años con infección por VHS-1
y 491 millones de personas de 15 a 49 años
cursan con infección por VHS-2 en el mundo;
sus síntomas, vesículas o ulceras dolorosas

Estudios de Seguridad Preclínica del extracto

hidroalcohólico de semillas de Opuntia soehrensii, una

especie alto-andina con actividad anti-Herpes Virus, en ratas

Sprague Dawley

Preclinical safety of the hydroalcoholic extract of Opuntia soehrensii seeds

with anti-herpes virus activity, in SD rats.

Abstract

Background: Around 3.7 billion people

under  50  years  of  age  are  infected  with  HSV-
1  and  491  million  people  between  the  ages
of  15  and  49  are  infected  with  HSV-2  in  the
world; his symptoms, vesicles or painful ulcers

* Magali Solares-Espinoza, https://orcid.org/0000-0001-5063-6697

Yeshika Lopez Gavincha, https://orcid.org/0000-0002-6470-1223

Gabriela Villalpando Ameller, https://orcid.org/0000-0002-2921-3830

Esther Casablanca Alarcón, https://orcid.org/0000-0002-8751-7568

Ivonne Contreras Tapia, https://orcid.org/0000-0001-7884-9790

Raquel Calderón Morales https://orcid.org/0000-0001-6862-4467

Curcuy Lanza Milet, https://orcid.org/0000-0002-9312-7830

Katty Terrazas Aranda, https://orcid.org/0000-0001-5487-7121

Roger Carvajal Saravia, https://orcid.org/0000-0003-3998-6658

Instituto Boliviano de Biología de la Altura (IBBA), Facultad de Medicina, Universidad Mayor de San Andrés

La Paz – Bolivia

Instituto de Servicios de Diagnóstico e Investigación en Salud (I. SELADIS) – Facultad de Ciencias

Farmacéuticas y Bioquímicas, UMSA. La Paz – Bolivia.

Hospital COSSMIL. La Paz – Bolivia.

*Autor de correspondencia: mfsolares@umsa.bo

Fecha de recepción: 7 Noviembre 2022

Fecha de aceptación: 14 Noviembres 2023

Solares, M. y Col.

recur periodically. Conventional treatment
decreased its effectiveness in resistant and
immunosuppressed

strains. Therapeutic

alternatives with extracts of medicinal plants
and  antiviral  potential,  such  as  Opuntia
soehrensii  Brito  known  as  "ayrampù"
in  Bolivia,  uses  infusion  of  its  seeds  as
an  analgesic,  antidiabetic,  hypotensive
and  febrifuge.  In  vapors  by  inhalation  for
respiratory conditions; as a topical tincture in
skin  lesions  of  smallpox,  measles  and  cold
sores.

Objectives. To evaluate the preclinical

safety of a gel containing the hydroalcoholic
extract of Opuntia soehrensii seeds in
different doses, applied to the vaginal mucosa
of Sprague Dawley rats.

Material and Methods. Acute and sub-

acute  toxicity  protocols  were  carried  out
to  evaluate  local  response  in  the  vaginal
mucosa,  through  histo  pathological  studies,
and systemic responses, through biochemical
and behavioral markers, in groups of animals
to which the gel with different concentrations
of  the  extract  of  Opuntia  soehrensii  was
applied,  compared  with  a  control  group  and
another that received only the vehicle.

Results. It was found that the histological

indicators  of  local  reaction  and  cell  integrity
were  equally  distributed  in  all  groups.
Cytology  showed  conservation  of  the  cell
phenotype  for  the  phases  of  the  estrous
cycle  in  all  groups.  The  systemic  indicators
of  behavior  and  weight  gain  did  not  show
differences  between  groups.  Hematological
and  biochemical  indicators  showed  results
ranged  in  physiologic  parameters,  without
changes in the study groups.

Conclusion. The application of a gel from

Opuntia soehrensii does not show appreciable
levels of local and systemic toxicity, which
makes it possible to recommend the initiation
of clinical application studies.

reaparecen  periódicamente.  El  tratamiento
convencional disminuyó su efectividad en cepas
resistentes  e  inmunodeprimidos.  Alternativas
terapéuticas  con  extractos  de  plantas
medicinales y potencial antiviral, como Opuntia
soehrensii  Brito  conocida  como  “ayrampù”  en
Bolivia,  utiliza  infusión  de  sus  semillas  como
analgésico, antidiabético, hipotensor y febrífugo.
En  vapores  por  inhalación  para  afecciones
respiratorias;  como  tintura  tópica  en  lesiones
dérmicas de viruela, sarampión y herpes labial.

Objetivo.

Evaluar

seguridad

preclínica  de  un  gel  que  contiene  el  extracto
hidro-alcohólico  de  semillas  de  Opuntia
soehrensii  en  diferentes  dosis,  aplicado  en
la  mucosa  vaginal  de  ratas  Sprague  Dawley.

Material y métodos. Se ejecutaron

protocolos de toxicidad aguda y subaguda para
evaluar  la  respuesta  sistémica,  a  través  de
marcadores bioquímicos y de comportamiento,
y  la  respuesta  local  en  mucosa  vaginal,
mediante estudios histopatológicos, en grupos
de  animales  a  los  que  se  aplicó  el  gel  con
diferentes  concentraciones  del  extracto  de
Opuntia soehrensii, comparados con un grupo
control  y  otro  que  recibió  solo  el  vehículo.

Resultados. Se encontró que los

indicadores  sistémicos  de  comportamiento  y
ganancia  de  peso  no  mostraron  diferencias
entre  grupos.  Los  indicadores  hematológicos
y

bioquímicos

mostraron

resultados

fi siológicamente  esperados  y  sin  cambios  en
los  grupos  de  estudio.  La  citología  expuso
conservación  del  fenotipo  celular  para  las
fases  del  ciclo  estral  en  todos  los  grupos.
Los  indicadores  histológicos  de  reacción
local  e  integridad  celular  se  distribuyeron
de  igual  manera  en  los  todos  los  grupos.

Conclusión. La aplicación de un

gel  de  Opuntia  soehrensii  no  muestra
niveles  apreciables  de  toxicidad  local  y
sistémica,  lo  que  permite  recomendar  la
iniciación  de  estudios  de  aplicación  clínica.

Palabras claves
Opuntia sp., herpes virus, antiviral,
ratas Sprague Dawley, Toxicidad
aguda y subaguda

Key words
Opuntia sp., antiviral,
Herpesviridae, Sprague Dawley
rats, sub-acute toxicity.

Estudios de Seguridad Preclínica del extracto hidroalcohólico de semillas de Opuntia soehrensii,

una especie alto-andina con actividad anti-Herpes Virus, en ratas Sprague Dawley

INTRODUCCIÓN

Se estima que en todo el mundo hay 3700 millones de personas menores de

50 años (67%) con infección por VHS-1 y 491 millones de personas de 15 a 49 años
(13%) cursan con infección por VHS-2. La mayoría de las infecciones por VHS son
asintomáticas, pero entre los síntomas del herpes se incluyen vesículas o ulceras
dolorosas  que  pueden  reaparecer  periódicamente  al  cabo  de  un  tiempo  (OMS,
2023), (Berger Stephen, 2022). El uso constante del tratamiento convencional con
base en Aciclovir, Famciclovir y otros, ha disminuido la efectividad del tratamiento
por la aparición de cepas resistentes, particularmente en sujetos inmunodeprimidos.
Este panorama evidencia la necesidad de búsqueda de alternativas en los productos
naturales. Los extractos de plantas medicinales con potencial terapéutico antiviral
son  una  opción  que  contribuye  al  tratamiento  de  este  tipo  de  enfermedades,
mediante  diferentes  mecanismos.  (Mårten  Strand,  2014),  (Ariza-Heredia  et  al.,
2018), (Álvarez et al., 2020), (Majewska & Mlynarczyk-Bonikowska, 2022), (Garber
et al., 2021), (Lin et al., 2022).

Entre los recursos fi to terapéuticos utilizados para este tipo de patologías, se

encuentra  Opuntia  soehrensii  Brito,  también  conocida  como  “ayrampù”,  que  es
una  Cactaceae  de  los  valles  andinos  secos  en  Bolivia,  ampliamente  empleada
por  la  medicina  tradicional.  Se  utiliza  infusión  de  sus  semillas  como  analgésica,
antidiabética,  hipotensor  y  febrífugo.  En  forma  de  vapores  por  inhalación  son
aplicadas para afecciones del tracto respiratorio; asimismo, la solución concentrada
como tintura se aplica de forma tópica para el control de las lesiones dérmicas de
la  viruela,  sarampión  y  en  el  herpes  labial.  La  solución  acuosa  de  este  producto
también se emplea como bebida refrescante y el extracto como colorante para la
repostería. (Camaqui Mendoza Alberto, 2009).

En nuestro laboratorio se estudió las potencialidades terapéuticas del extracto

hidro-alcohólico de las semillas de O. soehrensii in vitro. Se demostró la actividad
antiviral protectora in vitro antes de la infección celular (Mamani V. Gaby, 2004). A
tiempo de estudiar la actividad antiviral, se estudió el efecto cito-tóxico en células BHK-
21 evaluando la concentración del producto, el tiempo de exposición y la densidad
celular puesta en cultivo. Se observó efecto tóxico en concentraciones mayores a
0.21mg/dL en cultivos con menor densidad celular y en concentración de 42 mg/dL
con mayor densidad celular. La concentración cito-tóxica media (CC

) del producto en

estudio, en células BHK-21 con una densidad celular de 3x105/mL, hasta las 72 horas
de cultivo fue de 21 mg/dL (Mamani V. Gaby, 2004), (Zambrana Santander Silvia T.,
2006, 2007). El objetivo del presente estudio fue, evaluar la seguridad preclínica de
un gel que contiene el extracto hidro alcohólico de semillas de Opuntia soehrensii en
diferentes dosis, aplicado en la mucosa vaginal de ratas Sprague Dawley, para lo cual
se realizó ensayos de toxicidad aguda y subaguda a dosis repetidas.

Solares, M. y Col.

MATERIAL Y METODOS

Extracto vegetal: Los especímenes de Opuntia soehrensii fueron autenticada

por  el  Herbario  Nacional  (Instituto  de  Ecología,  Carrera  de  Biología)  Facultad  de
Ciencias Puras de la Universidad Mayor de San Andrés, con el número de registro
3 (Carvajal R. y López Y. 2014); estos provenían de las cercanías de la ciudad de
Tupiza Departamento de Potosí.  La recolección de los frutos se realizó en horas de la
mañana; las semillas fueron inmediatamente separadas, desecadas a temperatura
ambiente,  al  abrigo  de  la  luz  por  14  días,  para  luego  proceder  a  su  trituración  a
polvo fi no en mortero de porcelana. 40 g de este material fueron suspendidos en 1
litro de agua bidestilada y des ionizada, esta suspensión se agitó por 2 horas a 50º
C para su posterior maceración durante 48 horas. Luego de eliminar las sustancias
insolubles  por  fi ltración  con  papel  Whatman  No1,  alícuotas  del  extracto  acuoso
fueron concentradas por liofi lización (Labconco, Freeze Dry System).

Preparación del gel: En 500 mL de agua destilada des ionizada se vertió 5 g

de Carbopol U 10% (Sigma) y se homogeneizó en licuadora, después de lo cual se
añadió 6 gotas de Trietilamina (TEA), para polimerizar el Carbopol y dar lugar al gel.
Este producto con un pH de 4.2 fue conservado a 4ºC en condiciones estériles. Para
la incorporación del extracto vegetal en el gel, el material liofi lizado fue reconstituido
en solución salina, a diferentes concentraciones, partiendo de una solución stock de
100 mg/mL del extracto el cual se esterilizó por fi ltración en membranas de millipore
de 0.45µm. Las concentraciones obtenidas fueron añadidas al gel con agitación
constante a temperatura ambiente.

Tratamiento de los animales: Se emplearon 58 ratas Sprague Dawley

(Rattus  norvergicus)  hembras,  de  240  a  280  g  de  peso,  reproducidas  y  criadas
en  el  Bioterio  de  la  Unidad  Fisiología  Experimental  del  Instituto  Boliviano  de
Biología  de  la  Altura  de  la  Facultad  de  Medicina,  Universidad  Mayor  de  San
Andrés.  Estas,  fueron  alojadas  en  cajas  individuales  de  policarbonato  con
cama  de  viruta  de  madera  estéril.  Todas  recibieron  alimento  estándar  (Pellets
elaborados  por  la  Empresa  SFIDA  S.  R.  L.  de  Ferrari  Ghezzi  Oruro  Bolivia)  y
agua tratada por osmosis inversa y esterilizada por acidifi cación (pH 3.5). Agua y
alimentos fueron administrados ad libitum. Diariamente se controló la temperatura
ambiente  mantenida  en  22ºC  como  promedio,  humedad  del  45%  y  el  ciclo  luz-
oscuridad 12 x 12, con focos de luz blanca fría de 14 watts. Desde el inicio de los
experimentos, cada animal fue identifi cado mediante tarjetas adheridas a la caja,
que incluían los datos individuales y de grupo. Los procedimientos experimentales
se  diseñaron  de  acuerdo  con  normas  de  bioética  internacionales,  consignadas
en “International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals” y
OECD (Organization for Economic Cooperation and Development). Los estudios
de toxicidad aguda y subaguda como respuesta local, se diseñaron como un test

Estudios de Seguridad Preclínica del extracto hidroalcohólico de semillas de Opuntia soehrensii,

una especie alto-andina con actividad anti-Herpes Virus, en ratas Sprague Dawley

en mucosa vaginal, basado en los protocolos de prueba en piel OECD TG 404
(OECD Paris, 2015).

Administración del producto: La administración del producto se realizó según

la técnica de frotis vaginal en ratas, validada por el Centre de Recherche du CHUQ,
2009 (Centre de Recherche du CHUQ, 2009); que consiste en la inmovilización
del animal para exposición de la región ano genital. El procedimiento se realizó
utilizando jeringas descartables de 1 mL (sin aguja); se administró 200 microlitros
del gel con diferentes concentraciones del extracto y vehículo (Carbopol U10% de
Sigma Aldrich).

Evaluación del comportamiento: El test de Irwin permitió la evaluación de 34

variables, como respuesta de tres áreas del SNC: área motora, efectos generales
y  efectos  subjetivos.  El  procedimiento  consistió  en  técnicas  observacionales  y
maniobras  específi cas  para  obtener  respuestas  refl ejas  (Moscardo  et  al.,  2007),
(Lazo R., 2022). También se evaluó la ganancia de peso (balanza marca “OHAUS”),
el consumo de alimento, de agua, y la temperatura corporal (termómetro “Physitemp”
TCAT-2AC).  Los  procedimientos  fueron  realizados  manualmente  por  el  mismo
personal (capacitado y adiestrado previamente) y a la misma hora. (Zúñiga J. M.,
2001).

Evaluación de parámetros hematológicos: Se realizó punción cardiaca

post eutanasia, por inhalación de halotano, para la obtención de ±5 mL de sangre
que  fueron  depositadas  en  tubos  de  hemolisis  con  anticoagulante  (EDTA-K3)  y
homogeneizadas por agitación. Para determinar el micro hematocrito las muestras
fueron  incorporadas  en  capilares  sin  anticoagulante.  Para  el  conteo  diferencial
de  glóbulos  blancos  y  plaquetas,  se  realizó  un  extendido  de  gota  fresca  sobre
portaobjetos y se utilizó la tinción de Wright, lectura al microscopio con aceite de
inmersión, y clasifi cación de las células según patrones morfológicos (Harstad Eric,
2016). Los parámetros hematológicos determinados fueron: hemoglobina, mediante
espectrofotometría a partir de una solución preparada con 5 mL de Drabkin + 20µL de
muestra (lectura de DO longitud de onda de 540 nm), hematocrito, por el método de
micro hematocrito mediante centrifugación del capilar a 1300 rpm; recuento manual
de glóbulos blancos y plaquetas utilizando una cámara de conteo de Malassez y
tampón específi co.

Determinaciones de Química Clínica: Las muestras fueron depositadas en

tubos  de  hemolisis  y  sometidas  a  centrifugación  (3000  rpm)  durante  10  minutos;
las alícuotas de sueros se depositaron en tubos Eppendorf ±500 µL y congelados
a  -80ºC  para  realizar  las  determinaciones  en  un  mismo  momento.  Las  pruebas
fueron  colorimétricas  y  enzimáticas  de  acuerdo  con  estándares.  Se  utilizaron
reactivos específi cos para espectrofotometría (Labkit Erba Mannheim) en un equipo
automatizado para el cálculo de la absorbancia (Erba diagnostics Mannheim GMBH
biochemistry analyzer Chem5V3). Los indicadores bioquímicos evaluados fueron:

Solares, M. y Col.

glucosa, colesterol, triglicéridos, proteínas totales, GOT, GPT, urea y creatinina,
(Zúñiga J. M., 2001). (Salvador et al., 2008)

Evaluación de microbiota vaginal: Se realizó mediante la técnica de frotis

vaginal en ratas; la toma de muestra fue por hisopado y colectados en tubos de
ensayo que contenían caldo enriquecido con tioglicolato. El recuento e identifi cación
de colonias permitió evaluar cocos y bacilos Gram (+) y (-), como microbiota general.

Evaluación del fenotipo celular vaginal: Se aplicó la técnica de lavado vaginal

en ratas con 500 µL de solución fi siológica cargada en una pipeta Pasteur; se realizó
el lavado-aspirado en el mismo momento y la acción fue realizada por la misma
persona. El producto obtenido fue depositado en tubos Eppendorf y fi jado con una
gota de formol. La siguiente fase fue de extendido sobre un portaobjetos con fi jación
por desecación y tinción Papanicolaou. La observación se realizó en microscopio
óptico en 10X y 40X (Marcondes, F. K., 2002), (Gomes Vilela Marcio, 2007), (Paccola
C.C., 2013), (Cora Michelle C., 2015).

Evaluación histológica: Se obtuvieron por ectomía post mortem útero y

vagina, región perineal, hígado y riñones. Después de su valoración macroscópica
fueron fi jados en formol al 40%. Se realizó cortes sagitales en la pieza anatómica
correspondiente  a  la  vagina  que  se  colocaron  en  cassettes  para  su  fi jación  en
parafi na  y  posterior  deshidratación  por  alcoholes  durante  16  horas  en  un  equipo
automatizado  Histokinet  modelo  48XHK.  Luego  se  hicieron  cortes  de  3  micras  y
tinciones por inmersión y tinción universal hematoxilina-eosina. La lectura se hizo en
un microscopio óptico Olimpus BX43F, en 10X y 40X. (Crum C.P., 2000), (Tomlinson
L., 2016), (Ramaiah S.K., 2016).

Análisis estadístico: Los resultados fueron sometidos a contrastes de

normalidad  mediante  pruebas  de  Shapiro-Wilk  y  Kolmogorov-Smirnov.  Para  el
análisis de signifi cancia se aplicaron pruebas no paramétricas como U de Mann-
Whitney y Kruskall-Wallis y pruebas paramétricas como ANOVA, aceptando p <0.05
como  valor  de  diferencia  estadísticamente  signifi cativa.  Se  aplicó  la  prueba  de
correlación de Pearson ® para mostrar la ganancia de peso en cada grupo y en
el tiempo que duró el estudio. Los datos cualitativos fueron matematizados a partir
de la asignación de scores de Likert para valores ordinales (1=ausente, 2=escaso,
3=moderados y 4= abundantes) y sometidos a pruebas de signifi cancia estadística.
En  general  los  resultados  se  expresan  como  medias  ±SD.  Para  todo  el  análisis
estadístico se utilizó el programa SPSS V19.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Toxicidad Aguda: Se establecieron dos grupos (n=5): control, que no recibió el

producto, y experimental que recibió una dosis única del gel con el extracto vegetal
de Opuntia soehrensii (2.1 mg/mL dosis máxima, según equivalencia con los

Estudios de Seguridad Preclínica del extracto hidroalcohólico de semillas de Opuntia soehrensii,

una especie alto-andina con actividad anti-Herpes Virus, en ratas Sprague Dawley

estudios previos in vitro (Zambrana Santander Silvia Tatiana, 2007), por aplicación
vaginal. Los criterios de cambios en el comportamiento se evaluaron a las 1, 2, 4, 8
y 24 horas, mediante Test de Irwin (Moscardo et al., 2007). La citología vaginal fue
examinada en estado basal y postratamiento. La eutanasia química con halotano y
la obtención de muestras se efectuó después de tres días de observación.

El Test de Irwin, la evaluación del peso corporal, consumo de alimento y

agua mostraron valores dentro de los rangos fi siológicos y no se observaron
diferencias signifi cativas entre los grupos de estudio (U de Mann-Whitney p<0.05).
Los parámetros hematológicos y bioquímicos mostraron valores fi siológicamente
estables y no se observaron diferencias estadísticamente signifi cativas (U de Mann-
Whitney p<0.05). No hubo necesidad de aplicar el punto fi nal humanitario y el índice
de mortalidad fue nulo.

El microbiota vaginal mostró presencia moderada de bacilos Gram (-) seguida de

la categoría “abundantes” en ambos grupos. Al contrario, se observó predominio de
“ausencia” de Cocos Gram (+), seguido de algunos casos “escasos” y “moderados”.
La tabla 1, muestra estas características.

Tabla 1. Microbiota vaginal durante toxicidad aguda

Parámetros

Control (n=5)

Experimental (n=5)

Basal

Postratamiento

Basal

Postratamiento

Bacilos Gram (-)

1.2 ±0.28 1.2 ±0.28

NS 1.1 ±0.14 1.2 ±0.28

Bacilos Gram (+) 0.8 ±0.0 1.2 ±0.0

NS 0.8 ±0.28 0.8 ±0.28

*Los valores muestran las medias ±1 SD. La signifi cancia fue determinada mediante la prueba
U de Mann-Whitney. NS: no signifi cativo

La citología vaginal evaluó la fenotipifi cación celular durante el ciclo estral de

cada ejemplar, la respuesta fue fi siológica en ambos grupos. También se examinó
la presencia de neutrófi los como expresión de las células inmunitarias in situ: las
respuestas fueron similares en estado basal y post tratamiento en ambos grupos
de estudio. La integridad celular fue evaluada mediante la presencia de restos
celulares, los resultados mostraron predominio de la categoría “ausentes”, seguida
de “escasos” en ambos grupos de estudio.

La evaluación histológica local mediante parámetros como necrosis tipo

apoptosis, halo claro perinuclear, núcleos claros y vacuolizaciones no mostró
diferencias entre los grupos experimental y control (tabla 2).

Solares, M. y Col.

Tabla 2. Parámetros histológicos de integridad celular

Parámetros

Control (n=5)

Experimental (n=5)

Necrosis tipo apoptosis

0.8 ±0.3

Halo Claro Perinuclear

0.8 ±0.3

0.8 ±0.0

Núcleos Claros

0.8 ±0.0

0.8 ±0.3

Vacuolizaciones

0.73 ±0.30

0.9 ±0.14

*Los valores muestran medias ±1SD. p<0.05, mediante prueba U de Mann-Whitney.
NS: no signiﬁ cativo

Estos parámetros de integridad celular fueron complementados por la

evaluación histológica de células inmunitarias in situ. No se observaron diferencias
signifi cativas en la presencia de neutrófi los en el plano superfi cial ni en el plano del
corion del epitelio vaginal; los linfocitos en el plano superfi cial mostraron discretas
diferencias, en cambio, en el plano del corion no mostraron ninguna diferencia.
A nivel del epitelio de transición no se observaron diferencias importantes que
impliquen toxicidad del producto.

Toxicidad subaguda: Se establecieron cinco grupos de ratas hembra Sprague

Dawley sin contacto previo con ejemplares macho: grupo vehículo (n=10), grupo
dosis mínima (n=10), grupo dosis media (n=10), grupo dosis máxima (n=10) y grupo
control (n=8). Durante 14 días recibieron diariamente por vía vaginal el gel con
extracto de Opuntia soehrensii, en tres concentraciones (dosis mínima 0.21 mg/dL,
dosis media 0.66 mg/dL y dosis máxima 2.1 mg/dL), un grupo recibió gel sin extracto
vegetal (grupo vehículo) y otro no recibió ningún producto, pero fue sometido a la
maniobra de administración (grupo control). En todos los grupos se distribuyeron los
animales al azar y de acuerdo con los diferentes pesos (240-280 g).

El comportamiento de los animales fue evaluado mediante el test de Irwin

en tres áreas del SNC: (área motora, efectos generales y efectos subjetivos).
Los resultados de los diferentes parámetros mostraron similitudes entre todos los
grupos, con ausencia de mortalidad y morbilidad.

La ganancia de peso a lo largo de los 14 días mostró los incrementos

fi siológicamente esperados (Tabla 3), no se observaron diferencias signifi cativas
entre los grupos estudiados. Los consumos de alimento y agua no fueron diferentes
entre los grupos. La tabla 3, muestra los valores encontrados.

Estudios de Seguridad Preclínica del extracto hidroalcohólico de semillas de Opuntia soehrensii,

una especie alto-andina con actividad anti-Herpes Virus, en ratas Sprague Dawley

Tabla 3. Parámetros generales evaluados en la toxicidad subaguda, en los diferentes
grupos

Parámetros

Control Vehículo DOSIS

Mínima Media

Máxima

Incremento de pesos a
lo largo de 14 días (r)*

0.87

0.94

0.87

0.406

Consumo de alimento
g/24 horas**

15.92
±1.19

15.53
±2.13

16.31
±3.08

17.5
±4.59

16.19
±2.86

0.658

Consumo de agua
mL/100g/día**

33.92
±5.85

34.49
±5.44

36.44
±3.41

33.79
±3.08

32.69
±3.34

0.407

*r valor obtenido por regresión lineal que muestra la ganancia de peso durante el tiempo de
estudio. La signifi cancia (p<0.05) se exploró aplicando la prueba de Kruskall-Wallis.
**Muestran promedios ±1SD. La signifi cancia de p <0.05 se determinó mediante ANOVA.

Los valores hematológicos en los diferentes grupos de estudio fueron similares

para todos los parámetros examinados. La Tabla 4, muestra los resultados obtenidos.

Tabla 4. Parámetros hematológicos

Control

Vehículo

DOSIS

Parámetros

Mínima

Media

Máxima

Hemoglobina
g/dL

15.84 ±1.5

15.6 ±0.95 16.34 ±1.915.6 ±0.8

15.2 ±0.8

0.358

Plaquetas /
mm3

547500
±130623.8

616600
±97384.9

657000
±55425.6

585800
±141824.5

566600
±87515.3

0.203

Glóbulos
blancos/mm3

7507
±1705.9

7370
±2051.4

7876
±1534.0

7996
±2030.4

7790
±2347.5

0.952

Neutróﬁ los/
mm3

1627.2
±580.2

1452.2
±473.9

1708.3
±460.5

1880.0
±879.2

1653.8
±700.8

0.675

Linfocitos/
mm3

5435.27
±1134.9

5505.06
±1591.1

5495.9
±1033.7

5701.0
±1352.7

5713.22
±1608.2

0.977

Monocitos/
mm3

386.9
±133.9

341.4
±175.8

318.12
±146.9

365.2
±145.2

332.1
±157.7

0.885

*Los valores representan promedios ±1SD. La p (con signifi cancia <0.05) fue determinada
utilizando la prueba de ANOVA.

La química clínica evaluó nueve marcadores de rutina, cuyos resultados se

muestran en la Tabla 5. La signifi cancia (p<0.05) fue determinada mediante la
prueba ANOVA para diversos grupos.

Solares, M. y Col.

Se aprecia que las diferencias entre grupos no fueron estadísticamente

signifi cativas y los rangos encontrados permanecieron entre los rangos fi siológicos.

Tabla 5. Marcadores bioquímicos
Parámetros

Control

Vehículo DOSIS

Mínima

Media

Máxima

Triglicéridos mg/
dL

76.04
±20.53

75.33
±21.84

79.12
±13.21

75.14
±18.08

78.96
±38.9

0.994

Colesterol
mg/100mL

46.68
±12.54

47.7
±9.96

49.8
±9.6

50.3
±11.6

46.6
±12.9

0.918

Urea mg/100mL

77.67
±5.01

75.56
±7.8

81.69
±12.85

77.1
±7.7

78.6
±14.4

0.894

Creatinina mg/dL 0.81 ±0.9 0.80

±0.07

0.80 ±0.11 0.79 ±0.100.80 ±0.140.992

Proteínas totales
g/dL

5.24
±1.01

5.3 ±0.97 5.3 ±1.2

5.13 ±1.2 5.2 ±1.5

0.998

GPT UI/L

40.62
±4.20

39.43
±4.4

38.45
±7.64

40.46
±6.24

37.59
±5.35

0.754

GOT UI/L

87.67
±6.74

80.39
±9.03

77.16
±14.14

80.11
±10.26

80.89
±12.17

0.654

Bilirrubina total
mg/dL

0.15 ±0.4 0.15

±0.09

0.16
±0.04

0.15
±0.05

0.14
±0.07

0.940

Glucosa mg/dL

152.98
±34.02

149.3
±34.6

152.98
±34.02

137.25
±28.87

149.20
±44.98

0.854

*Los valores muestran promedios ±1SD. La signifi cancia (p<0.05) fue determinada mediante
la prueba ANOVA.

La evaluación del microbiota vaginal mostró presencia de bacilos Gram (-) a

predominio de E. coli entre moderados y abundantes en los cinco grupos estudiados.
La fi gura 1, muestra estas características. No se identifi caron bacilos Gram (+) en
ninguno de los casos. Por otro lado, se evaluó la presencia de cocos Gram (+) y (-).

Estudios de Seguridad Preclínica del extracto hidroalcohólico de semillas de Opuntia soehrensii,

una especie alto-andina con actividad anti-Herpes Virus, en ratas Sprague Dawley

Figura 1. Distribución de bacilos Gram (-) microbiota vaginal, en ratas Sprague Dawley
hembras que recibieron aplicación vaginal del extracto de Opuntia soehrensii en gel.

Respecto a los Cocos Gram (+), predominó la ausencia de estos en todos

los grupos. La presencia de cocos Gram (-) fue menor en estado basal que en el
post tratamiento en los grupos control, vehículo y dosis mínima, a diferencia de los
grupos media y máxima en los que, los casos abundantes fue menor; esto podría
estar relacionado con los hábitos de limpieza de la zona ano-genital en los roedores,
la misma que se realiza mediante el lamido; en ese orden, se podría asumir que una
mayor concentración del producto alteró la palatabilidad en la zona, provocando
ausencia de lamido de limpieza a mayores concentraciones del gel de Opuntia.

En la citología vaginal por frotis se observó que el fenotipo celular conservó

sus características fi siológicas para cada fase del ciclo estral y en cada uno de los
ejemplares, tanto en estado basal como post tratamiento. Las células inmunitarias
y  restos  celulares  in  situ  mostraron  similitudes,  con  predominio  de  ausencia  de
neutrófi los  en  estado  basal  y  post  tratamiento  en  todos  los  grupos;  en  similar
proporción  fue  seguido  de  presencia  escasa  y  moderada  también  en  todos  los
grupos.  Los  restos  celulares,  estuvieron  entre  ausentes  y  presencia  escasa  en
todos los grupos, en ningún caso se observaron diferencias signifi cativas.

La histología in situ, evaluó la probable reacción infl amatoria mediante la

presencia o ausencia de neutrófi los y de linfocitos (Crum, 2000), en dos planos
celulares: a) plano celular superfi cial y corión de epitelio vaginal y b) plano superfi cial
y dermis en epitelio de escamoso del área de unión con piel. En plano superfi cial de
epitelio vaginal, la proporción de neutrófi los se distribuyó entre ausentes y presencia
escasa, para todos los grupos; a nivel del plano profundo o corion todos los grupos

Solares, M. y Col.

fueron predominantemente escasos, seguidos de presencia moderada para todos
los grupos, no se observaron diferencias signifi cativas.

En el área de unión de epitelio escamoso con piel, a nivel del plano superfi cial

se observó ausencia de neutrófi los en alta proporción. En el plano profundo o dermis
se observó igual proporción entre ausencia y presencia escasa en todos los grupos.
La cuantifi cación de estos valores se muestra en la tabla 6, en la que se observa la
inexistencia de diferencias estadísticas entre los grupos estudiados, estableciendo
que no hubo reactividad infl amatoria aguda al gel en el nivel local.

Los Linfocitos en epitelio vaginal en el plano superfi cial fueron ausentes

o  escasos  en  todos  los  grupos;  en  el  nivel  del  plano  profundo  la  respuesta  se
distribuyó  entre  escasos,  ausentes  y  moderados  de  manera  similar  en  todos  los
grupos, En el área de unión del epitelio escamoso con la piel de la región vulvar, las
características en el plano superfi cial fueron de ausencia total en todos los grupos.
En el plano profundo, en todos los grupos se observó distribución proporcional entre
ausencias y presencia escasa, con un ejemplar que mostró presencia moderada en
el grupo vehículo. Lo anterior muestra que tampoco hubo reactividad infl amatoria de
tipo crónico en los tejidos genitales de los animales tratados con el gel.

También evaluamos cuatro parámetros de integridad celular: necrosis tipo

apoptosis, halo claro perinuclear, núcleos claros y vacuolizaciones. La necrosis
tipo apoptosis (NTA), es un tipo de muerte celular producido por estímulos nocivos
administrados en dosis bajas, como fármacos cito tóxicos anticancerosos o
inclusive la hipoxia. En todos los grupos hubo ausencia de esta variable de forma
predominante, seguida de presencia escasa en todos los grupos.

El halo claro perinuclear (HCP), se describe a nivel de células superfi ciales e

intermedias, (llamadas precancerosas y conocidas como coilocitos), que muestran
la  presencia  de  una  vacuola  alrededor  del  núcleo.  Es  un  indicador  de  respuesta
infl amatoria.  La  proporción  dominante  fue  ausencia  de  este  parámetro  en  todos
los  grupos,  observándose  solo  un  ejemplar  con  presencia  escasa  por  grupo  en
vehículo, dosis mínima y dosis máxima. Los núcleos claros (NC), son característicos
de  las  células  del  epitelio  cilíndrico  endocervical  que  tienen  marcada  fragilidad
citoplasmática,  lo  que  lleva  a  observar  núcleos  desnudos  o  claros,  enmarcados
por  un  anillo  nuclear  condensado  hacia  la    periferia  (Rodríguez  Costa,  2018).
Estos  núcleos  claros  o  en  vidrio  esmerilado  se  observan  de  manera  abundante
en los casos de Herpes virus en humanos (García Bermejo, 2018). Los resultados
mostraron distribución entre ausencia y presencia escasa en todos los grupos. Las
vacuolizaciones (Vac), en las células del epitelio vaginal son parte de la expresión
de los mecanismos de modulación del pH como protector contra agentes patógenos
externos (Gartner & Hiatt, 1997). De forma patológica estas imágenes se pueden
observar cómo acumulación anormal de agua en el citoplasma celular en forma de
pequeñas vacuolas, denominada degeneración hidrópica o vacuolar (Ríos Dalenz

Estudios de Seguridad Preclínica del extracto hidroalcohólico de semillas de Opuntia soehrensii,

una especie alto-andina con actividad anti-Herpes Virus, en ratas Sprague Dawley

J., et al., 1998). Los resultados mostraron ausencia en elevada proporción en todos
los grupos, con algunos casos de presencia escasa y moderada en todos los grupos
con excepción del grupo control. La tabla 6, muestra los resultados, y la ausencia de
diferencias signifi cativas entre los grupos control y los experimentales. Se establece
así que la aplicación del gel de manera diaria a lo largo de 14 días en el tracto
genital no genera cambios que sean expresión de reactividad inducida por irritación
o efecto toxico.

Tabla 6. Marcadores de integridad celular y células de respuesta inmunitaria

Parámetros

Control Vehículo DOSIS

Mínima Media Máxima

Necrosis Tipo
Apoptosis

0.8 ±0.30.5 ±0.06 0.7

±0.14

0.7
±0.10

0.55
±0.25

0.128 0.683 0.683 0.248

Halo Claro
Perinuclear

1.12
±0.0

0.65
±0.5

0.7
±0.40

1.12
±0.0

0.7
±0.5

0.221 0.221 1.00

0.221

Núcleos Claros 0.7

±0.09

0.65
±0.21

0.71
±0.0

0.6
±0.2

0.7
±0.14

1.00

0.543 1.00

Vacuolizaciones 1.12

±0.0

0.5
±0.3

0.6
±0.13

0.6
±0.14

0.6
±0.13

0.180 0.147 0.157 0.180

Neutróﬁ los en
plano superﬁ cial

0.7
±0.3

0.5
±0.15

0.7
±0.14

0.65
±0.07

0.7
±0.14

0.374 1.00

1.00

Neutróﬁ los en
corion

0.8
±0.3

0.5 ±0.2 0.6

±0.06

0.95
±0.07

0.53
±0.30

0.374 0.519 0.683 0.374

Linfocitos en
plano superﬁ cial

0.65
±0.07

0.65
±0.21

0.7
±0.42

0.8
±0.60

0.65
±0.21

1.00

Linfocitos en
corion

0.6
±0.4

0.6
±0.45

0.6
±0.22

0.8
±0.42

0.6
±0.42

1.00

0.724 0.374 1.00

*Los valores centrales muestran medias ±1SD. La signifi cancia estadística para p<0.05 se
determinó mediante la prueba U de Mann-Whitney. p1 diferencias, entre grupos control y
vehículo, p2 entre grupo control y dosis mínima, p3 entre grupo control y dosis media, p4
entre grupo control y dosis máxima.

CONCLUSIONES

La evaluación sistémica de los marcadores de afectación toxica evidenció

el estado saludable de los ejemplares estudiados mediante parámetros de
comportamiento y marcadores hematológicos y bioquímicos. La identifi cación de la
microbiota, no mostró variaciones signifi cativas en post administración del producto,
por lo que asumimos no existir efectos negativos a ese nivel. La citología evidenció
conservación de: el fenotipo celular durante las fases del ciclo estral, los neutrófi los y
restos celulares in situ, ya que se mantuvieron constantes en todos los grupos tanto

Solares, M. y Col.

en el estudio agudo como en el subagudo. Los hallazgos histológicos de integridad
celular, como NTA, NC mostraron distribuciones similares en todos los grupos.
Otros parámetros como HCP y Vac mostraron leves diferencias entre los grupos
que podrían explicarse por una coincidente mayor actividad estrogénica en algunos
de los ejemplares. Finalmente, la histología de hígado y riñones mostró integridad
celular y funcional. Concluimos que Opuntia soehrensii no muestra indicadores de
toxicidad signifi cativos.

AGRADECIMIENTOS:

Proyecto desarrollado con fondos de la Cooperación Sueca ASDI-SAREC. Al

personal del bioterio del IBBA: Sra. H. Mamani, Sra. R. Sandoval y Sr. J. Condo. A
Belizabeth Cárdenas Miranda, Lic. Lab. Clin.

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