REVISTA CON-CIENCIA 2023, Vol. 11, No 2

DOI: https://doi.org/10.53287/haxv1678ag35o

Resumen

Introduction: Para estudiar el efecto

de cualquier producto natural, aunque sea
de uso habitual de la medicina tradicional,
es necesario establecer previamente los
márgenes de seguridad para su utilización
en humanos. En el caso de Erythroxylum
coca, para trazar sus perspectivas de uso
como fitofármaco o de producto industrial,
es necesario conocer si tiene algún grado
de toxicidad o si es completamente inocuo,
no obstante, su larga tradición de consumo.

Objetivo: Explorar el efecto de un

extracto hidro-alcohólico de E. coca sobre
granulocitos y mononucleares de voluntarios
donadores humanos, en condiciones de
cultivo celular. Se examinó, por un lado, el
efecto sobre la viabilidad celular y la actividad

La Viabilidad y Funcionalidad de Leucocitos Humanos en

presencia de un Extracto Hidro-alcohólico de E. coca

The Viability and Functionality of Human Leukocytes in the presence of a

Hydro-alcoholic Extract of E. coca.

Abstract

Background: In order to study the effect

of any natural product, even if it is commonly
used in traditional medicine, it is necessary to
previously establish the safety margins for its
use in humans. In the case of Erythroxylum
coca, in order to trace its prospects of use as
a phytopharmaceutical or industrial product, it
is necessary to know if it has any degree of
toxicity or if it is completely innocuous, despite
its long tradition of consumption.

Objective: To explore the effect of a hydro-

alcoholic extract of E. coca on granulocytes
and mononuclear cells of human donor
volunteers, under cell culture conditions. We
examined, on the one hand, the effect on cell
viability and the activity of the mitochondrial/
cytoplasmic oxidoreductase system and, on

* Ximena Padilla, https://orcid.org/0000-0003-1796-3586

Katty Terrazas, https://orcid.org/0000-0001-5487-7121

Roger Carvajal, https://orcid.org/0000-0003-3998-6658

Unidad de Biomedicina Experimental, Unidad de Virología, Inmunidad e Infección. Instituto de Servicios

de Laboratorio de Diagnóstico e Investigación en Salud (SELADIS). Facultad de Ciencias Farmacéuticas y

Bioquímicas. UMSA, La Paz, Bolivia.

*Autor de correspondencia: ximenitapliz@gmail.com

Fecha de recepción: 10 mayo 2023

Fecha de aceptación: 23 enero 2024

Padilla, X.

y Col.

the other hand, it was explored its effect on
cellular functionality through the determination
of phagocytic capacity, chemotaxis,
endocytosis and microbicidal activity, in the
fi eld of innate immunity, and the capacity of
release or stimulation of cytokines in the fi eld
of inﬂ ammatory response.

Materials and Methods: Viability by

Trypan Blue, oxidoreductase activity by
MTT reduction, endocytic capacity of yeast,
chemotaxis in agarose gel towards Fmlp
peptide and microbicidal activity on S.aureus
were evaluated. Cytokine release was
evaluated by ELISA.

Results: It was found that at doses

equivalent to the usual human consumption,
leukocytes retain their viability (0.13µg/ml),
which is maintained up to relatively high
doses (130µg/ml). In this safety range it was
found that E. coca does not alter the capacity
of mitochondrial and cytoplasmic oxidation-
reduction enzymes, on the contrary, at low
doses it is able to stimulate such activity. The
chemotactic activity is not affected by the
hydroalcoholic extract of coca, on the contrary,
at intermediate doses this activity is ostensibly
elevated. The endocytic capacity is not affected
and, on the contrary, a stimulus of the same
was observed; in the microbicidal activity there
are no signifi cant changes.

Conclusions: It is concluded that

this product, at doses equivalent to those
recommended by traditional medicine, has
no deleterious effects on the viability and
functionality of human leukocytes. Regarding
the activity of the extract on the production
of cytokines, it was found that E. coca has a
stimulating effect on the release of TNF and
inhibition of IL-10, thus modulating greater
proinﬂ ammatory activity.

del sistema mitocondrial/citoplasmático de
óxido-reductasas y, por otra parte, se exploró
su efecto sobre la funcionalidad celular a
través de la determinación de la capacidad
fagocítica, la quimiotaxis, la endocitosis y
la actividad microbicida, en el ámbito de
la inmunidad innata, y la capacidad de
liberación o estimulación de citoquinas
en el ámbito de la respuesta inﬂ amatoria.

Materiales y Métodos: Se evaluó la

viabilidad por Azul Tripan, la actividad de oxido
reductasas por reducción de MTT, la capacidad
endocitica de levaduras, quimiotaxis en gel
de agarosa hacia el péptido Fmlp y actividad
microbicida sobre S.aureus. Las liberaciones
de citoquinas se evaluaron por ELISA.

Resultados: Se encontró que a las

dosis equivalentes a la del consumo habitual
humano, los leucocitos conservan su viabilidad
(0,13µg/ml), la que se mantiene hasta dosis
relativamente altas (130µg/ml). En esta franja
de seguridad se encontró que E. coca no altera
la capacidad de las enzimas mitocondriales
y citoplasmáticas de óxido- reducción,
al contrario, en dosis bajas es capaz de
estimular dicha actividad. La actividad
quimiotactica no es afectada por el extracto
hidroalcoholico de coca por el contrario a dosis
intermedias esta actividad se eleva de manera
ostensible. La capacidad endocitica no se ve
afectada y por el contrario se pudo observar
un estímulo de la misma; en la actividad
microbicida no existe cambios signifi cativos.

Conclusiones: Se concluye que, este

producto a las dosis equivalentes a las
recomendadas por la medicina tradicional no
tiene efectos deletéreos sobre la viabilidad
y funcionalidad de los leucocitos humanos.
En lo que respecta a la actividad del extracto
sobre la producción de citoquinas, se encontró
que E. coca tiene efecto de estimulación en
la liberación de TNF e inhibición de IL-10
modulando así mayor actividad proinﬂ amatoria.

Palabras claves

Inmunidad innata, Coca,

inﬂ amación, medicina tradicional

Key words

Innate immunity, Coca,

inﬂ ammation, traditional medicine.

La Viabilidad y Funcionalidad de Leucocitos Humanos en presencia de

un Extracto Hidro-alcohólico de E. coca

INTRODUCCIÓN

La herbolaria medicamentosa nativa de los andes centrales utiliza ampliamente

las hojas de coca en forma de infusiones, ungüentos y harina ingerida, para el manejo
de diversas entidades mórbidas. Entre estas se cita, preferentemente, procesos
inﬂ amatorios articulares, osteoporosis, espasmos viscerales, contracturas y estados
de ansiedad/depresión, trastornos ventilatorios en la altura, tumores e infecciones
(Rojas, 2013; Penny et al., 2009) . Por todo lo anterior, dada la promisoriedad de
este producto como recurso terapéutico con perspectivas de industrialización, cobra
importancia realizar estudios pre-clínicos y clínicos en las patologías citadas. Sin
embargo, para abordar estas tareas es indispensable explorar, de manera previa,
la inocuidad de este producto a través de estudios de seguridad que determinen
las dosis a las cuales puede ser utilizado con la sufi ciente seguridad en modelos
preclínicos y clínicos. Para esto, se consideró que, a la ingestión de los derivados
de la coca, particularmente la harina (como la indican los médicos tradicionales)
continúa la absorción de sus componentes y el contacto con las células sanguíneas.
En ese sentido, tiene importancia establecer si los componentes de este producto
pueden afectar a dichos componentes de la sangre, particularmente a los que están
encargados de la primera línea de la defensa del organismo: los leucocitos. Estudiar
este posible efecto, además de permitir conocer la inocuidad o toxicidad del derivado
para evidenciar una franja de seguridad en estudios in vitro e in vivo, permitiría
conocer si tiene actividad sobre la funcionalidad de dichas células inmunitarias.

En el presente trabajo se exploró el efecto de un extracto hidro-alcohólico de

E. coca (EHAEc) sobre células mononucleares y polimorfonucleares de sangre
periférica de donadores sanos en sistemas de cultivo celular. Se determinó, por
un lado, el efecto sobre la viabilidad celular y la actividad del sistema mitocondrial/
citoplasmático de óxido- reductasas y, por otra parte, se exploró su efecto sobre
la funcionalidad celular a través de la capacidad fagocítica, la quimiotaxis, y la
capacidad microbicida. Además, se estudió la inﬂ uencia en la liberación de citoquinas
pro y anti inﬂ amatorias.

Aspectos Éticos

El protocolo de investigación ha sido aprobado por el comité de ética de la

UMSA al momento de su aprobación por los fondos IDH 2013-2014 para el Proyecto
RES.C.T.A.88/2017; RES.H.C.F. N°179/17 “Investigación pre-clínica de la toxicidad/
inocuidad de E. coca: estudios in vitro e in vivo en modelos experimentales animales”
Instituto SELADIS-UMSA del cual forma parte este trabajo.

Padilla, X.

y Col.

MATERIAL Y MÉTODOS

Extracto de E. coca. Las hojas de coca fueron provistas por los técnicos

del Viceministerio de la Coca y Desarrollo Integral, y provenían de un cultivo en
parcela controlada en la región de Los Yungas (Coripata), en la que no se aplicaron
productos químicos en calidad de pesticidas.

Para eliminar partículas y microorganismos que pudiera contener el producto,

este fue lavado con agua corriente y después sumergido 3 veces por 5 minutos,
de manera continuada y secuencial, en una solución de etanol al 70 % en agua tri-
destilada. Después se secaron las hojas a temperatura ambiente. Una vez secas
las hojas fueron molidas en molino (BUHLER MIAG Milán) con cuchillas de acero
inoxidable a diámetro semi-fi no (como harina) obteniéndose un polvo que fue
macerado en una solución de etanol con agua al 50 % en proporción 100 gramos de
hoja por 1 litro p/v., por 48 horas. El sobrenadante fue fi ltrado en papel Whatman3
y sometido a evaporación en rotaevaporador para eliminar el alcohol. El agua fue
eliminada por liofi lización en un equipo Labconco. Se logró un polvo fi no, que fue
conservado a 4 °C hasta su uso. El rendimiento promedio fue de 16%. Las dosis
a las que se utilizó el extracto fueron calculadas en base a lo que corresponde a
equivalencia a 3 gramos de harina de coca consumida por el ser humano (con
base a las indicaciones de la medicina tradicional), asumiendo que el extracto tiene
un rendimiento defi nido y que en contacto con un número determinado de células
puede equivaler al contacto de un extracto con las células del organismo completo,
particularmente con las células sanguíneas, una vez absorbidos sus componentes.

Donadores voluntarios sanos. Sobre la base de criterios de exclusión

(fumadores, enfermedades infecciosas recientes, episodios de ansiedad y depresión)
e inclusión (edad entre 21 y 36 años), se seleccionaron 9 sujetos clínicamente
sanos con base en un examen clínico en el que no se detectaron signos ni síntomas
que demuestren alteraciones morfológicas o fi siológicas evidentes. A los 9 sujetos
(6 mujeres y 3 hombres) clínicamente saludables, se les efectuó una radiografía
P.A. de tórax, un electrocardiograma y un barrido ecográfi co abdominal. Se les
tomó sangre para practicar un hemograma completo y pruebas bioquímicas que
exploran los perfi les hepático, renal, pancreático y metabólico. Una vez confi rmada
la condición de salud por estar los parámetros bioquímicos y hematológicos dentro
de los límites de la población normal, para su edad, y los reportes de gabinete
sin alteraciones detectables, se los convocó para la aceptación explícita del
consentimiento informado. En diferentes fechas se hicieron las tomas de muestra
de sangre venosa periférica en ayunas, para el estudio propuesto.

Separación y preparación de células. Las células se obtuvieron de la

separación de sangre periférica heparinizada de humanos voluntarios aparentemente
sanos. La sangre fue mezclada en partes iguales con una solución de PBS Ph: 7,2

La Viabilidad y Funcionalidad de Leucocitos Humanos en presencia de

un Extracto Hidro-alcohólico de E. coca

y luego se procedió a la centrifugación y separación por gradientes de densidad
con Ficoll-Hypaque de dos densidades diferentes, Histopaque 1,077 (SIGMA-
ALDRICH), para separar células mononucleares e Histopaque 1,119 (SIGMA-
ALDRICH), para separar células polimorfo-nucleares. Se separó primero la interface
de células mononucleares para luego separar las células polimorfonucleares (PMN);
los pellets obtenidos se lavaron tres veces con PBS centrifugando a 1100 rpm, se
resuspendieron en medio RPMI-1640 (SIGMA-ALDRICH) suplementado con suero
fetal bovino al 10% y antibióticos, para luego determinar la viabilidad y número de
células por exclusión con azul tripan en cámara de Neubauer (Corredor R, 1994).

Determinación de la viabilidad Celular por el método de exclusión de Azul

Tripan. Se procedió a mezclar 0.20 µL de la suspensión celular con 0.20 µL de la
solución de azul tripan al 0.4%, relación 1:1; posteriormente se cargó a una cámara
de Neubauer para realizar el conteo en microscopio donde se diferenció las células
viables, de una tonalidad refringente, de las células no viables teñidas de azul. Se
contó 4 cuadrantes de la cámara y se hizo el cálculo de viabilidad y número de
células (Strober, 2015).

Ensayo de MTT. Este ensayo se basó en una modifi cación del método original

de (Mosmann, 1983). La reducción de MTT por las células se realizó mediante la
incubación de 1x10

cel/ml en placas de cultivo de 96 pozos las cuales se pusieron

a incubar en diferentes tiempos (24 y 48 horas) con diferentes concentraciones de
extracto hidroalcohólico de E. coca. El MTT (Sigma-Aldrich) fue disuelto en una
solución de PBS Ph:7,2, para obtener una concentración de 5mg/ml y luego se hizo
una dilución en RPMI sin Rojo fenol para obtener una concentración fi nal de 1mg/ml.
Se esterilizó por fi ltración con fi ltro millipore de 0.2 µm de poro y luego se adicionó
100 µL de la solución en los pozos con la suspensión celular para ser incubada por
4 horas a 37°C, 99% de humedad y 5%CO2. Para disolver los cristales de formazan
generados, se añadió etanol absoluto y luego la absorbancia fue determinada a 405
nm con fi ltro diferencial de 630 nm en el lector de ELISA (Awareness INC, USA)
(Bernas y Dobrucki, 2002; Berridge, Herst, y Tan, 2005; Vistica et al., 1991).

Determinación de la actividad quimiotáctica. El procedimiento fue realizado

a partir de la modifi cación al método de Nelson, Quie, y Simmons (1975) y Dahl y
Lindroos, (1979). Se disolvió una mezcla de agarosa con gelatina sin sabor como
matriz de proteínas; la solución se mezcló con RPMI 2X y luego se vaciaron en
placas Petri. Después de su gelifi cación se realizaron perforaciones en el gel en tres
líneas paralelas. Se preparó el péptido quimioatractante N formyl-methionyl-Leucyl-
phenylalanine (f-MLP, Sigma. Co) a una concentración fi nal a 10-

M, con base en lo

reportado por Dahl & Lindroos, (1979) y Chenoweth, Rowe, y Hugli (1979), que señalan
las concentraciones máximas de actividad hidroalcohóli de los péptidos formilados
(Schiffmann, Corcoran, Wahl, 1975; Showell et al., 1976; Williams, Snyderman, Pike,
y Lefkowitz, 1977). Posteriormente se colocó 10µL de PMN (1x10

cel) en los pocillos

Padilla, X.

y Col.

del centro, 10µL del péptido hidroalcohóli f-MLP en los pocillos superiores y 10µL de
medio RPMI en los pocillos inferiores. Se dejó en incubación por 2 horas a 37°C y
luego se detuvo la migración con la adición de metanol absoluto por 30 minutos, para
luego cambiar con metanol fresco. Se dejó 18 horas en incubación, luego se procedió
a colorear con tinción Panóptica Rápida y se dejó secando para observar y medir el
frente de la migración en milímetros (John y Sieber, 1976).

Ensayo de Capacidad Endocítica. La prueba se realizó usando levaduras de

Saccharomyces cerevisae (Levadura Fleishmann) las cuales fueron hidratadas con
PBS a temperatura ambiente; estas se dejaron en reposo, disgregando los cúmulos
por acción del Vortex cada 15 minutos. Para el ensayo se tomó las levaduras que
se encontraban dispersas en el sobrenadante, el cual se centrifugo a 1500 rpm para
ser concentradas; se lavó dos veces el pellet con solución de PBS y se resuspendió
en 1ml de la misma solución. Se determinó la población de levaduras por conteo en
cámara de Neubauer con objetivo 40X. Posteriormente las levaduras se pusieron
en contacto con las células previamente incubadas en presencia de extracto hidro-
alcohólico de E. coca por 3 horas; luego se lavó con PBS para remover las levaduras
no endocitadas para después proceder a fi jar y teñir con Tinción Panóptica Rápida
y llevar a observar con objetivo de inmersión, realizando el conteo en 5 campos de
células (Terrazas,1993).

Evaluación de la capacidad microbicida. Se utilizó una cepa de Staphylococcus

aureus coagulasa (+) identifi cada y proporcionada por el laboratorio de bacteriología
del Instituto SELADIS. El método usado fue una modifi cación de los protocolos de
(Heather A. Parker, 2014; Hampton, Vissers, y Winterbourn, 1994; Leijh, Van Den
Barselaar, y Van Furth, 1981). Se tomó una cantidad de colonias de 18 horas de
cultivo para llevar a una suspensión de concentración de 2x10

bacterias/ml. Con

anterioridad se puso a incubar por 3 horas las células hidroalcohó en presencia del
extracto de E. coca a una concentración de 2x10

cel/ml. Luego se puso en contacto

las células incubadas con la suspensión de bacterias, se centrifugó la mezcla a 1100
rpm durante 15 minutos. Se desechó el sobrenadante para proceder a sembrar por
triplicado en Agar Sangre un tubo control a tiempo 0 para determinar el número
de bacterias real en contacto con las células. Los demás tubos conteniendo las
células con las bacterias se dejaron incubando por 3 horas a 37°C y 5% de CO

para que se lleve a cabo la fagocitosis, se lavó el pellet con PBS, se recolecto y
fueron sembrados los sobrenadantes por triplicado. Luego se resuspendió el pellet
en medio RPMI y se colocó en placas de 96 pozos para incubar por 30 y 60 minutos
para que se lleve el proceso de digestión de lo endocitado; posterior a este tiempo,
se detuvo este proceso por adición de agua albuminada al 0,1 % y un cambio brusco
de temperatura de 37°C a -20°C; luego se sembró por triplicado en Agar Sangre el
contenido de cada uno de los pocillos y se realizó el conteo de numero de colonias
formadas para determinar el número de UFC/ml.

La Viabilidad y Funcionalidad de Leucocitos Humanos en presencia de

un Extracto Hidro-alcohólico de E. coca

Detección de citoquinas. Las citoquinas se detectaron en el sobrenadante

de células mononucleares cultivadas con el extracto hidroalcohólico a diferentes
concentraciones. Se dividieron las células en 2 grupos: en uno de ellos se incubo solo
con extracto, el otro contenía células previamente activadas con Lipopolisacarido
(LPS), dado que este estimulante es el más versátil, en concentración de 10µg/
ml. Para la obtención de sobrenadantes se realizó el cultivo por 24 horas con
extracto de E. coca en la dosis más relevante obtenida con los resultados previos
de funcionalidad celular. Posteriormente se centrifugaron los cultivos de las células
y se recolecto los sobrenadantes los cuales se congelaron a -20°C hasta su uso.
La liberación de Interleucina 1β(IL-1β), Interleucina-6 (IL-6), Interleucina-8 (IL-8),
Interleucina 10 (IL-10), Factor de necrosis tumoral (TNF), e Interferón gamma (INFγ)
en sobrenadantes de cultivo celular fue determinada usando el kit HU OptEIA SET
(B&D Bioscience) de acuerdo a instrucciones del fabricante.

Análisis estadístico. Para establecer las diferencias estadísticas de las

variables se usó la prueba de ANOVA de una y dos vías usando el programa PRISM
6.0® GraphPad Software Inc., San Diego, CA.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Para explorar un posible efecto toxico del Extracto hidroalcohólico de E. coca

sobre células humanas de sangre periférica, mononucleares y polimorfonucleares
obtenidos de voluntarios humanos fueron expuestas a diferentes concentraciones del
extracto hidroalcohólico de Erytrhoxylum coca, en condiciones de cultivo celular, por
diferentes periodos de tiempo (24 y 48horas). En la fi gura 1 se aprecia los resultados
de la evaluación en cultivos primarios de mononucleares del conjunto de los 9 sujetos
voluntarios. Se advierte que a las 24 hr., la viabilidad celular se mantiene hasta la dosis
de 130 µg/ml en 80% y hasta 1300 µg/ml en 75%. Estos resultados se reproducen de
manera casi idéntica en todos los casos. A las 48 hr. La viabilidad celular se mantiene
hasta la dosis de 13µg/ml en un 80% y hasta 130µg/ml en un 75%.

Figura 1. Viabilidad por azul tripan en células mononucleares en 24 horas y 48
horas de cultivo se expresa el promedio ±1SD, de tres experimentos por triplicado
de 9 donantes voluntarios

Padilla, X.

y Col.

En la fi gura 2 se aprecia los resultados de esta evaluación en cultivos primarios

de polimorfonucleares del conjunto de los 9 sujetos voluntarios, se observa un
comportamiento similar al de las células mononucleares.

Figura 2. Viabilidad por azul tripan en células polimorfonucleares en 24 horas y 48
horas de cultivo se expresa el promedio ±1SD, de tres experimentos por triplicado
en 9 donantes voluntarios

En la fi gura 3 se aprecia los resultados de la medición de la actividad enzimática

mitocondrial de la reducción de MTT en cultivos primarios de mononucleares de los
9 voluntarios.

Figura 3. Evaluación in vitro del efecto sobre la actividad enzimática mitocondrial y
citoplasmáticas en células mononucleares y polimorfonucleares de los 9 pacientes
voluntarios se expresa el promedio ±1SD, de tres experimentos por triplicado en 9
donantes voluntarios

Se advierte que la actividad enzimática celular se eleva en algunos casos, en

porcentajes menores al 20%, en la dosis de 1,3µg/ml y 13µg/ml en un 20% respecto al
control. En cultivos primarios de polimorfonucleares se ve un comportamiento similar
a las células mononucleares siendo leve estimulación a la dosis de 13µg/ml. Estos
resultados permiten establecer que, la actividad mitocondrial de las oxido-reductasas
no se altera en presencia del extracto de E. coca, a las dosis no toxicas; asimismo

La Viabilidad y Funcionalidad de Leucocitos Humanos en presencia de

un Extracto Hidro-alcohólico de E. coca

no solamente no afecta esta actividad, sino que, aparentemente, esta es promovida
a las dosis intermedias. Esto podría correlacionar con el hecho de que este producto
es consumido para aumentar la capacidad de consumo de oxígeno en el organismo y
con esto la resistencia a la fatiga y el aumento de la fortaleza física temporal.

En relación a la funcionalidad de los leucocitos referida a su movilidad,

la fi gura 4 muestra los resultados de la evaluación de la quimiotaxis de células
polimorfonucleares que migraron hacia el péptido N-FMLP en placas de gel de
agarosa de 9 voluntarios. Se puede observar que no solo no se altera la capacidad
de migración dirigida de estas células en respuesta a quimio-atractantes, sino que
existe un leve incremento en presencia del extracto (alrededor de un 20 a 30%)
respecto al control (0 µg/ml), a dosis de 1,3 µg/ml y 13 µg/ml.

Figura 4. Evaluación de la quimiotaxis de células polimorfonucleares que migraron
hacia el péptido N-FMLP en placas de gel de agarosa

Lo anterior permite inferir que este producto, una vez en contacto con las células

sanguíneas no interfi ere con su funcionalidad en lo relacionado a la capacidad de
tomar contacto con microorganismos para ejercer las funciones de defensa, de las que
son la primera barrera. Este hecho podría tener trascendencia durante los procesos
de defensa inmunológica contra microorganismos, toda vez que el quimioatractante
utilizado es un derivado de los quimioatractantes naturales de los microorganismos
que, cuando ingresan al organismo, provocan la llegada masiva de células defensivas.
Esto correlacionaría con algunas propuestas de la medicina tradicional sobre el papel
de la hoja de coca en el control de enfermedades infecciosas.

En ese mismo propósito, también fue examinada la capacidad de estas células

para fagocitar y digerir microorganismos, in vitro. La fi gura 5 muestra la evaluación
de la capacidad endocítica de las células mononucleares en presencia de diferentes
concentraciones del extracto; se puede observar un leve aumento (alrededor
de 19% respecto al control) de dicha función, aunque no se considera que sea
estadísticamente signifi cativa; en las células polimorfonucleares se ve un aumento
de esta función alrededor de un 21% a la dosis de 130µg/ml respecto al control.

Padilla, X.

y Col.

Figura 5. Evaluación de la capacidad endocitica en células mononucleares
y polimorfonucleares, se expresa el promedio ±1SD, de tres experimentos por
triplicado la diferencia estadística entre dosis respecto al control fue*=p < 0.05,
**=p < 0.01, ***=p < 0.001

Lo observado permite proponer que E. coca no tiene capacidad de afectación

negativa de la funcionalidad de los leucocitos humanos, al menos en lo que
corresponde a su capacidad migratoria y endocitica; al contrario, parece estimular
esta última función a dosis bajas, lo cual podría tener connotaciones favorables en
su uso como fármaco, hecho compatible con la valoración que hace la medicina
tradicional andina de este producto. Para redondear el estudio del extracto sobre la
funcionalidad de las células que se constituyen en la primera barrera defensiva dentro
de la inmunidad innata, se exploró la actividad microbicida de células mononucleares
y polimorfonucleares humanas. Se encontró, tal como lo evidencia la fi gura 6, que
este extracto no modifi ca la función de eliminación de microorganismos ya que a
las diferentes concentraciones ambos tipos de células son capaces de procesar S.
aureus in vitro de manera similar a lo que efectúan las células sin el extracto.

Figura 6. Evaluación de la capacidad microbicida de células mononucleares y
polimorfonucleares tratadas con el extracto h.a. de Erytroxilum coca. Se expresa el
promedio ±1SD, de tres experimentos por triplicado; la diferencia estadística entre
dosis respecto al control fue: *=p < 0.05, **=p < 0.01, ***=p < 0.001

La Viabilidad y Funcionalidad de Leucocitos Humanos en presencia de

un Extracto Hidro-alcohólico de E. coca

Lo anterior, ratifi ca la idea de que E. coca en su encuentro con las células

leucocíticas de sangre humana no tiene efectos deletéreos en su función
defensiva, explorada por los procedimientos ensayados reportados en este
trabajo. En lo referente a la posibilidad de que este producto tenga efectos sobre
el funcionamiento de los mononucleares, en relación con su capacidad para
liberar autacoides involucrados en la inﬂ amación, se exploró in vitro el efecto de
las concentraciones estudiadas en los experimentos anteriores sobre la liberación
de diferentes citoquinas. La fi gura 7a muestra que IL-1β, una citoquina inductora
de  inﬂ amación  por  diferentes  vías,  existe  una  muy  leve  estimulación  de  su
liberación  de  que  no  es  estadísticamente  signifi cativa(p>0.05)  en  ensayos  con
estimulación previa con LPS como activador policlonal (en lugar de antígeno); en
los ensayos sin estimulación se observó que no existe modifi caciones en relación
con el control. Por su parte, se observó que no existe una liberación o inhibición
signifi cativa estadísticamente en la liberación de IL-6 – una citoquina involucrada
en la estimulación de la inﬂ amación propia de procesos infecciosos y autoinmunes-
tanto en los ensayos con estimulación de LPS como los sin estimulación (Fig. 7b).
Asimismo, se pudo observar que no existe estimulación ni inhibición en la producción
de IL-8 por parte del extracto (Fig. 7c). Para la IL-10 una citoquina involucrada en
procesos  de  modulación  tanto  positiva  como  negativa  de  la  inﬂ amación,  se  ve
que existe una dependencia inversa entre concentración utilizada del extracto y
respuesta, ya que a menor concentración del extracto existe mayor inhibición en la
liberación de esta, viéndose claramente esta dependencia inversa en la respuesta
de células con estimulación de lipopolisacarido (LPS) por 24 horas y no así en
los ensayos sin estimulación de lipopolisacarido (Fig.7d). Para TNF, la Figura 7e
muestra una leve pero signifi cativa estimulación de su liberación en los cultivos
sin presencia de LPS (casi 10 veces, con respecto al control, a la concentración
de 130 µg/ml del extracto); en el caso de los ensayos con LPS el leve aumento de
liberación observado no es estadísticamente signifi cativo. Al evaluar el efecto del
extracto hidroalcoholico de E. coca en la producción de Interferón gamma (Fig.
7f), una citoquina proinﬂ amatoria, se observó una leve inhibición (15% respecto al
control) a la dosis más baja en los ensayos con estimulación de LPS (p<0.05); en
los cultivos sin LPS no se apreció estimulación estadísticamente signifi cativos en
la producción de INF-γ.

Padilla, X.

y Col.

Figura 7. Evaluación de IL-1β, Il-6, IL-8, IL-10, TNF, INF-γ en células mononucleares
en 24 horas de cultivo celular tratadas con el extracto h.a. de Erytroxilum coca
y estimulación con Lipopolisacarido (LPS) como control positivo. n=3±1DS, la
signifi cancia estadística entre dosis respecto al control de células no tratadas fue
*=p < 0.05, **=p < 0.01, ***=p < 0.001

Como puede observarse, la posible actividad antiinﬂ amatoria de E. coca no

parece ser mediada a través de la modulación de la producción de citoquinas ya
que lo único que se observo es una leve inhibición de IFN-γ a dosis baja que podría
tratarse más bien de un epifenómeno no asociado a una dinámica de modulación
farmacológica de la inﬂ amación. En cambio, en contra de lo esperado, lo que se
observó con más consistencia es la estimulación de las células mononucleares en
su capacidad para producir Factor de Necrosis tumoral (TNF), una citoquina de
gran potencia proinﬂ amatoria, aun en ausencia de un estimulador policlonal (ante
ausencia de antígeno) como el LPS. La inhibición de la producción de IL-10 estaría
correlacionando con este último hallazgo ya que esta citoquina tiene mayormente
efectos proinﬂ amatorios. De ser así, habría que pensar en la existencia de
efectos proinﬂ amatorios, que pudieran relacionarse con la defensa del organismo,
particularmente en procesos tumorales, tal como lo reivindica la medicina tradicional
en el uso de la coca y algunos reportes de corte epidemiológico. De existir actividad
biológica para controlar la inﬂ amación en algunas patologías, ésta no dependería
de la modulación de las citoquinas pro o antiinﬂ amatorias sino de otros mecanismos
tales como los señalados en otros estudios en nuestro laboratorio: la capacidad

La Viabilidad y Funcionalidad de Leucocitos Humanos en presencia de

un Extracto Hidro-alcohólico de E. coca

de inhibición de la Fosfolipasa A2 enzima crucial en la formación de moléculas
inﬂ amatorias en los aspectos vasculares de dicho proceso.

CONCLUSIONES

El extracto hidroalcoholico de E. coca no se considera toxico para las células

mononucleares y polimorfonucleares en los rangos de 13 a 1300µg/ml siendo
estas dosis equivalentes a las de consumo humano, por tanto, se establece un
claro margen de seguridad benefi cioso al consumo de esta planta. Además, se
determinó que este producto favorece la actividad enzimática mitocondrial, hecho
que concuerda con los estudios de aumento de la capacidad respiratoria, además,
se vio que promueve a un aumento de la capacidad de ingestión de bacterias y en
la actividad migratoria de polimorfonucleares, y no tuvo efecto sobre la actividad
microbicida de las células. En lo que respecta a la actividad del extracto sobre la
producción de citoquinas se determinó que E. coca tiene efecto más en citoquinas
proinﬂ amatorias que antiinﬂ amatorias.

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Karla Rojas por la selección clínica de los voluntarios sanos y su

colaboración con el proyecto. A la Dra. Raquel Calderón del Instituto SELADIS-
UMSA por la gentil donación de la cepa de S.aureus y apoyo con los ensayos. Al
programa IDH por el fi nanciamiento brindado para la ejecución del proyecto. A la
Maestría en Ciencias Biológicas y Biomédicas y al programa UMSA-ASDI a través
del cual también se logró la realización de los distintos ensayos.

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