DOI: https://doi.org/10.53287/oxwp5437kk73d

Resumen

Introducción: La Proteína Quinasa Activada

por  AMP  (AMPK),  es  una  enzima  monitora  y
reguladora central del estado energético celular,
por tanto, es responsable de la respuesta celular
al  suministro  y  demanda  de  energía.  El  AMP
actúa como activador en condiciones de défi cit
energético, mientras que el ATP la inactiva cuando
las condiciones energéticas son más favorables.
Debido a su función central en el metabolismo,
la  AMPK  surge  como  un  blanco  proteico
prometedor  para  el  tratamiento  de  diferentes
enfermedades como la Diabetes Mellitus tipo 2
(DM2), Síndrome Metabólico (SM), Cáncer, entre
otros. Existen múltiples isoformas de AMPK que

Función biológica de AMPK- β2 en músculo esquelético y su

dinámica estructural después de la activación por SC4

Biological role of AMPK- β2 in skeletal muscle and its structural dynamics after activation by SC4

Abstract

Introduction: Protein Kinase Activated by

AMP (AMPK), is a monitor enzyme and a central
regulator of the energetic cellular state, therefore,
it  is  responsible  for  the  cellular  response  to  the
supply  and  demand  of  energy.  AMP  acts  as  an
activator in conditions of energy defi cit, while ATP
inactivates  it  when  energy  conditions  are  more
favorable.  Due  to  its  central  role  in  metabolism,
AMPK  appears  as  a  promising  protein  target
for  the  treatment  of  different  diseases  such
as  Diabetes  Mellitus  type  2  (DM2),  Metabolic
Syndrome (SM), and Cancer among others. There
are multiple isoforms of AMPK that are regulated
and differentially expressed throughout the body.

Dayana Pamela Bello-Kopa

, Brenda Gisela Martínez-Oliva

, Ricardo Enrique Grados-Torrez

Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés, Av. Saavedra

2224. La Paz, Bolivia.

Centro de Investigación de la Universidad Privada Abierta Latinoamericana (CIUPAL).

Cochabamba, Bolivia.

*Autor para correspondencia ric.grados@gmail.com
ORCID: 0000-0002-5690-3263
ORCID: 0000-0002-5909-0245
ORCID: 0000-0001-7287-2586

FECHA DE RECEPCIÓN: 29 AGOSTO 2022 FECHA DE ACEPTACIÓN: 14 NOVIEMBRE 2022

Ricardo Enrique Grados Torrez

The  β2-AMPK  isoform  is  expressed  almost
exclusively in skeletal muscle and since this is the
primary organ for Glucose disposal and storage,
β2-AMPK  has  an  established  role  as  a  driver
of  insulin-independent  Glucose  clearance.
The  activator  SC4  has  a  high  selectivity  for
β2-AMPK  and  due  to  its  biological  function;
it  could  serve  as  a  pharmacological  model
to  aid  the  treatment  of  metabolic  diseases.

Objective: To analize the molecular

dinamic

AMPK-

β2

activation.

Methodology: In the present work

employed

bioinformatics,

Chimera

1.15

and

Phyton

Molecular

Viewer.

Results: The in silico analysis allow us to

understand many many structural features related
to the action of SC4 on the trimeric structure of
AMPK, the specifi c amino acids involved in the
interaction and how its chemical structure gives
it  high  selectivity.  Thus,  this  structural  analysis
will  be  useful  in  order  to  broaden  the  criteria
for  extraction,  identifi cation  and/or  design  of
active  compounds  from  natural  sources,  with
similar  or  even  better  properties  than  SC4,
to  use  them  in  a  future,  with  a  therapeutic
approach  that  benefi ts  our  population.

se regulan y expresan diferencialmente en todo el
organismo. La isoforma AMPK–β2 se expresa casi
exclusivamente en músculo esquelético y dado que
este es el órgano primario para el almacenamiento
y eliminación de Glucosa, AMPK–β2 puede dirigir
su  homeostasis  por  una  ruta  independiente  a  la
Insulina.  La  molécula  activadora  SC4  tiene  una
gran  selectividad  por  AMPK–β2  y  debido  a  su
función  biológica,  podría  servir  como  modelo
farmacológico  para  coadyuvar  el  tratamiento  de
enfermedades metabólicas.

Objetivo: Análisis de la dinámica molecular

de activación de la AMPK–β2.

Metodología: En el presente estudio, se

emplean herramientas bioinformáticas como
Chimera 1.15 y Phyton Molecular Viewer.

Resultados: El análisis in silico permitió

comprender

varios

aspectos

estructurales

relacionados  con  la  acción  de  SC4  sobre  la
estructura trimérica de la AMPK, los aminoácidos
con  los  que  interacciona  y  cómo  su  estructura
química  le  otorga  gran  selectividad.  También
fue  útil  para  en  un  futuro,  ampliar  los  criterios
de  extracción,  identifi cación  y/o  diseño  de
compuestos activos a partir de fuentes naturales,
con  propiedades  funcionales  similares  o  aún
mejores  a  SC4,  para  así  poder  emplearlos  con
un  enfoque  terapéutico  que  benefi cie  a  nuestra
población.

PALABRAS CLAVE
AMPK–β2, SC4, Dinámica
Estructural, AMP, ATP, DM2.

KEY WORDS

β2-AMPK, SC4, Structural
Dynamics, AMP, ATP, DM2.

DOI: https://doi.org/10.53287/oxwp5437kk73d

INTRODUCCIÓN

La  Proteína  Quinasa  Activada  por  AMP  (AMPK),  es  una  enzima  metabólica
que actúa como un monitor y regulador central del estado energético celular
en  eucariotas,  por  tanto,  es  responsable  de  la  regulación  del  metabolismo
en  respuesta  al  suministro  y  demanda  de  energía.  Desde  una  perspectiva
funcional, las condiciones de agotamiento de energía (cuando la proporción
entre AMP/ATP se incrementa) causan la activación de la AMPK que conduce
a la regulación positiva de procesos catabólicos productores de ATP (como
la oxidación de ácidos grasos y la glucólisis) y la correspondiente regulación
negativa de procesos anabólicos (como la síntesis de colesterol, lípidos y la
gluconeogénesis) para así, restaurar los niveles de ATP y recobrar el balance
energético  celular (Carling  et  al.,2011;  Hardie,  2008;  Oakhill  et  al.,  2012;
Steinberg  and  Kemp,  2009).  Dada  esta  función  central  en  el  metabolismo,
la AMPK surge como un blanco proteico prometedor para el tratamiento de
diferentes enfermedades como la Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2), el Síndrome
Metabólico (SM) y el Cáncer (Hardie, 2013; Viollet et al., 2007). Sin embargo,
la  complejidad  de  esta  enzima  y  la  falta  de  comprensión  de  su  modo  de
acción  molecular  han  difi cultado  el  desarrollo  farmacológico  de  moléculas
activadoras de AMPK como enfoque terapéutico en estos trastornos.

ESTRUCTURA

La AMPK es un heterotrímero de 145 kDa con actividad Serina/Treonina quinasa,
formada por una Subunidad Catalítica α y dos Subunidades Reguladoras β y

γ (Figura 1). La Subunidad α incluye un Dominio Quinasa N-terminal (KD) o
Dominio  Catalítico  y  un  Dominio  de  Interacción  de  Subunidades  (SD)  que
juega un rol estructural mediando las interacciones con las subunidades β y γ.
Entre estas regiones, yace un Bucle que forma un Dominio Auto-Inhibidor (AID)
compuesto por un grupo de tres α hélices localizado en la región C-terminal de
KD. Adicionalmente, el dominio KD contiene un Bucle de Activación donde
se  encuentra  la  αThr172  que  es  susceptible  de  ser  fosforilada  en  respuesta
a  la  unión  de  nucleótidos  (AMP).  Por  otro  lado,  dos  Motivos  Reguladores
de Interacción de subunidades (αRIM1 y αRIM2) se encuentran localizados
en AID y SD, respectivamente, los cuales parecen tener un rol crítico en la
regulación  alostérica  de  la  AMPK  por  AMP  (Chen  et  al.,  2013;  Xiao  et  al.,
2011).

Ricardo Enrique Grados Torrez

Figura  1. A.  Esquema  de  la AMPK  (Extraído  y  modifi cado  de  Chen  et  al.,  2013).
B.  Estructura trimérica de la AMPK. Subunidad α (verde). Dominio Quinasa (KD)
con  la  αThr172.  Dominio  de  Interacción  de  Subunidades  (SD)  con  el  Motivo
Regulador  RIM2.  Dominio  Auto-Inhibidor  (AID)  con  el  Motivo  Regulador  RIM1.
Subunidad  β  (celeste).  Módulo  de  Unión  a  Carbohidratos  (CBM)  en  N-terminal.
Dominio  de  Interacción  de  Subunidades  (SD)  en  C-terminal.  Subunidad  γ
(amarillo).  Dominios  de  Unión  a  Nucleótidos  (NBD1-4).  El  Sitio  ADaM  entre

αKD y βCBM con la βSer108 (PDB: 4ZHX) ((Elaboración propia, Chimera 1.11.2).

DOI: https://doi.org/10.53287/oxwp5437kk73d

La  Subunidad  β,  posee  una  región  N-terminal  sin  una  estructura  defi nida
seguida de un Módulo de Unión a Carbohidratos (CBM) formada por hojas
plegadas  β  capaces  de  interaccionar  con  el  Glucógeno  (Polekhina  et  al.,
2005). La región C-terminal actúa como una estructura de andamio con un
Dominio de Interacción de Subunidades (SD) propio, que forma una estructura
con forma de hoja β extendida entre las Subunidades α y γ constituyendo un
núcleo de regulación. Una zona formada por un lóbulo pequeño N-terminal
localizado en el KD de la Subunidad α y el CBM de la subunidad β (residuos 76
–156), da origen a una región denominada como el sitio de Unión de Drogas
y Metabolitos Alostéricos (ADaM) que parece participar en la activación de
la AMPK tras su unión con moléculas pequeñas potencialmente activadoras
(Langedorf and Kemp, 2015). El sitio ADaM posee un residuo de βSer108 que
generalmente se encuentra fosforilada. Además, la Subunidad β puede sufrir
un proceso de α-N-miristoilación en el residuo de βGly2 que facilita su unión
reversible  con  la  membrana  celular  y  para  la  activación  de  otras  quinasas
(Oakhill et al., 2010; Steinberg and Kemp, 2009; Warden et al., 2001).

La subunidad γ está constituida por cuatro Motivos en tándem de Cistationina

β-Sintasa (CBS1-4) que son módulos estructurales de ~60 aminoácidos
(repetidos en tándem) organizados en dos hojas β entrelazadas con dos α
hélices circundantes. Un par de módulos CBS forman un dominio “Bateman”
el cual posee dos sitios de unión de nucleótidos, uno en cada lado (NBD1/2 y
NBD3/4). Los nucleótidos de Adenina como el ATP, ADP y AMP interaccionan
dinámicamente con los NBDs de esta subunidad. La activación alostérica de la
AMPK por AMP parece involucrar 3 de los 4 NBDs, sin embargo, la unión de
AMP con NBD3 puede ser el más importante (Langendorf et al., 2016).

Cada subunidad de la AMPK tiene múltiples isoformas (α1, α2, β1, β2, γ1,

γ2, γ3) que se regulan y expresan diferencialmente en todo el organismo. Por
ejemplo, las isoformas AMPK-α1 y α2 se distribuyen en el corazón (Kim et al.,
2012), mientras que la isoforma AMPK-α2/β2 se expresa casi exclusivamente
en el músculo esquelético que es el órgano primario para el almacenamiento y
eliminación de la glucosa. La isoforma AMPK-β2 puede dirigir la homeostasis
de la glucosa en músculo esquelético por una ruta independiente a la
insulina, por tanto, es un importante blanco terapéutico para el tratamiento de
enfermedades metabólicas (como la DM2) (Wojtaszewski et al., 2005; Scott et
al., 2008).

ACTIVACIÓN ALOSTÉRICA

AMPK detecta el estrés energético traducido en el incremento de AMP. Su
activación alostérica involucra la unión de AMP a tres NBDs (NBD1, 3 y 4), lo
que desencadena un cambio conformacional y un aumento en la fosforilación
del residuo αThr172 por quinasas como LKB1 y Proteína Quinasa 2 dependiente

Ricardo Enrique Grados Torrez

de Calmodulina (CaMKK2).  La unión de AMP además, mantiene protegida a
la αPThr172 de la acción de fosfatasas, promoviendo un desplazamiento del
bucle AID lejos del Dominio Catalítico (αKD). Por el contrario, la unión de
ATP promueve la inactivación de AMPK induciendo la defosforilación de α
Thr172 (Figura 2). Estudios indican que αRIM2 participa detectando el estado
de  unión  a  nucleótidos  de  la  Subunidad  γ  para  la  transducción  de  la  señal
hacia el Dominio Catalítico (αKD). Otros estudios, señalan que la fosforilación
de la βSer108 incrementa la estabilización del sitio ADaM que es importante
en la activación de la AMPK. Actualmente, existe un interés importante en el
desarrollo de fármacos Activadores de AMPK para su uso terapéutico potencial
en  el  tratamiento  de  distintas  enfermedades  metabólicas  (DM2,  Obesidad,
Enfermedades Cardiovasculares, etc) (Hardie and Alessi, 2013).

Figura  2.  Regulación  de  la  AMPK.  La  AMPK  es  activada  por  el  incremento  en
la  proporción  AMP  o  ADP/ATP  o  el  aumento  de  la  concentración  de  Ca2+.  La
fosforilación  de  αThr172  para  su  activación  (AMP-P)  es  catalizada  por  al  menos
dos  quinasas:  LKB1,  la  cual  parece  ser  constitutivamente  activa  y  CaMKK2
que  solo  es  activa  al  incrementarse  el  Ca2+  intracelular.  El  aumento  de  AMP
o  ADP  promueve  la  activación  de  la  AMPK  por  tres  mecanismos:  1.  La  unión
de  AMP/ADP  a  AMPK  produce  un  cambio  conformacional  que  promueve  su
fosforilación  por  quinasas  como  LKB1.  2.  La  unión  de  AMP/ADP  ocasiona  un
cambio  conformacional  que  inhibe  su  defosforilación  por  fosfatasas.  3.  La  unión
de AMP (excluyendo el ADP) produce la activación alostérica de la AMPK-P. Todos
estos  tres  efectos  son  antagonizados  por  el  ATP,  permitiendo  a  la  AMPK  actuar
como  un  sensor  de  energía  (Extraído  y  modifi cado  de  Hardie  y  Alessi,  2013).

DOI: https://doi.org/10.53287/oxwp5437kk73d

MOLÉCULAS ACTIVADORAS

La primera droga activadora de la AMPK fue AICAR (ribósido de
5-aminoimidazol-4-carboxamida) (Sullivan et al., 1994; Henin et al., 1995) que
administrada en ratones obesos y con resistencia a la Insulina, revirtió muchas
de sus anormalidades metabólicas (Song et al., 2002; Buhl et al., 2002). Por
otro lado, la Metformina también mostró capacidad activadora de la AMPK in
vivo. Estudios con ratones knock-out para la activación de AMPK en el hígado,
revelaron que la Metformina perdía su efecto anti-hiperglucémico, sugiriendo
que el mayor efecto de la droga ocurre reprimiendo la gluconeogénesis
por medio de la activación de la AMPK hepática (Shaw et al., 2005). Otros
estudios señalan que algunas saponinas como Damulin A y B, Foenumosida
B, Soyasapogenol B y Dioscin aisladas de plantas, disminuyen los factores de
transcripción adipogénicos a través de una ruta de señalización que implica la
activación de AMPK (Marrelli et al., 2016).

Actualmente, se han identifi cado pequeñas moléculas activadoras de primera
generación como A769662 (Abbott Laboratories), PF-06409577, Salicilato

el Compuesto 991 (Merck Sharp y Dohme Corporation and Metabasis

Therapeutics) que se unen al sitio ADaM. Se piensa que la activación de la
AMPK por estas moléculas se debe a la estabilización del sitio ADaM debido
al incremento en la fosforilación del residuo de βSer108 (Langendorf et al.,
2016). Sin embargo, estos activadores de primera generación muestran una
selectividad muy fuerte para la isoforma AMPK–β1 (Xiao et al., 2013; Cameron
et al., 2016).

Otro activador alostérico de la AMPK es el ácido 5-(5-hidroxil-isoxazol-3-il)-
furan-2-fosfónico (Compuesto 2 o C2) (Metabasis Therapeutics), este fármaco
es  impermeable  para  las  células,  por  tanto,  se  emplea  su  correspondiente
profármaco  el  di-iso-propil  fosfoéster  (Compuesto  13  o  C13)  que  estimula
preferentemente  a  la  isoforma  AMPK–α1  de  células  eucariotas.  AMP  y  C2
comparten probablemente el mismo sitio de unión y mecanismo de activación
debido a que sus efectos alostéricos no son aditivos y la actividad de ambos se
pierde en cepas mutantes insensibles a AMP (Kim et al., 2016). Otros estudios
pre-clínicos realizados in vivo indican que activadores como PF-739 y MK-
8722 mejoran la homeostasis de la glucosa en ratones diabéticos, sin embargo,
MK-8722 fue asociado con complicaciones cardiacas tras dosis prolongadas
(Myers et al., 2017). Estudios recientes señalan la importancia de la molécula
activadora SC4, puesto que tiene una gran selectividad por la isoforma AMPK–

β2. Estructuralmente, SC4 comparte con el compuesto 991 el anillo -3(ácido
2-metilbenzoico/ácido o-toluico) y el anillo del núcleo -2(imidazolpirina), pero
difi ere en la presencia de un átomo de Nitrógeno en la posición 4’ (Figura 3).
Debido a su función biológica, SC4 podría servir como modelo para ampliar el
repertorio de activadores o agonistas de AMPK–β2 y el desarrollo de fármacos

Ricardo Enrique Grados Torrez

más específi cos para tratar enfermedades metabólicas (Ngoei et al., 2018). Sin
embargo, la información estructural de cómo estos fármacos activadores se
unen y activan a la isoforma AMPK–β2 aún no está bien establecida (Ngoei et
al., 2018).

Figura 3. Estructura química de SC4 y C991. La fl echa indica el
Nitrógeno 4’ de SC4 (Extraído y modifi cado de Ngoei et al., 2018).

METODOLOGÍA

En este estudio, se realizó un análisis estructural comparativo y descriptivo
de diferentes estructuras cristalográfi cas de la AMPK humana, obtenidas de la
base de datos Protein Data Bank (PDB:

http://www.rcsb.org/

PDB 4ZHX: Estructura cristalográfi ca de la isoforma AMPK–α1 en complejo con
el activador A769662 y C2. Esta estructura fue utilizada para el modelamiento
de la Figura 1B.
PDB 6B2E: Estructura cristalográfi ca de la isoforma AMPK–α2β2γ1 humana en
complejo con el activador SC4 y AMP.
PDB 6B1U: Estructura cristalográfi ca de la isoforma AMPK–α2β1γ1 humana en
complejo con el activador SC4 y AMP.
PDB 4EAI: Estructura cristalográfi ca del núcleo de AMPK–β1 (Subunidad γ)
humana en complejo con AMP (activo).
PDB 4EAK: Estructura cristalográfi ca del núcleo de AMPK–β1 (Subunidad γ)
humana en complejo con ATP (inactivo).

Todas las estructuras fueron analizadas, evaluadas y modeladas mediante el
software Chimera v1.11.2. Las superposiciones y alineamientos estructurales

DOI: https://doi.org/10.53287/oxwp5437kk73d

fueron realizados mediante la herramienta Match Maker con una Iteración no
mayor a los 2 Å (Pettersen et al., 2004).

RESULTADOS

UNIÓN DE CS4 CON AMPK-β2

El  activador  sintético  SC4  se  une  en  el  sitio  ADaM  de  AMPK–β2  formado
por  la  interface  entre  sus  subunidades  α  y  β  (dominios  α-KD  y  β2-CBM,
respectivamente) (Figura 4A y B). El N4’ forma un puente salino (interacción
electrostática)  con  βD111  y  los  anillos  aromáticos  se  estabilizan  por  la
interacción  con  aminoácidos  hidrofóbicos  como  αV11,  αL18,  αV24,  αI46,

αF90, y βI115 y βV113 (Figura 4C).

Figura 4. β2-AMPK. A. Estructura heterotrimérica (Subunidad α verde claro,
Subunidad β celeste y Subunidad γ amarilla) unida a la molécula activadora CS4 (verde
dentro el recuadro morado).

B. Densidad electrónica de la superfi cie de unión de CS4

que corresponde al sitio ADaM formado entre los dominios α-KD (verde) y β2-CBM
(celeste). C. Residuos en el sitio ADaM que participan en la interacción entre CS4 y
AMPK. N4’ (+) forma una interacción electrostática con βD111 (-). βS108 se encuentra
en su estado fosforilado (activo) (PDB: 6B2E) (Elaboración propia, Chimera 1.11.2).

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COMPARACIÓN DE ADaM EN AMPK–β1 y β2

En el sitio ADaM de AMPK–β2 se encuentra βD111 que no está conservado
entre las diferentes isoformas de AMPK, este aminoácido interacciona
específi camente con el Nitrógeno localizado en la posición 4’ en la estructura
de CS4 (Véase Figura 3). Por el contrario, en el sitio ADaM de AMPK–β1 se
encuentra un βN111 (en lugar de βD111), lo que provoca que su interacción
con CS4 sea estructuralmente distinta (Figura 5).

Figura  5.  Superposición  del  sitio  ADaM  de  las  isoformas  de  AMPK–β1  y  β2.  En
la isoforma de AMPK–β2 el residuo βD111 (celeste) interacciona con 4’N de SC4
(verde),  mientras  que,  en  su  lugar,  en  la  isoforma  de  AMPK–β1se  encuentra  el
residuo βN111 (magenta) que modifi ca la confi guración de unión de SC4 (morado).
El  residuo  βR82/83  actúa  como  estabilizador.  En  ambos  casos  se  observa  el
cambio en la confi guración de los residuos. Por simplicidad se omitió la estructura
secundaria  de  la  isoforma  de  AMPK–β1  (PDB:  6B1U  isoforma  de  AMPK–α2β1γ1
y  PDB:  6B2E  isoforma  de  AMPK–α2β2γ1)  (Elaboración  propia,  Chimera  1.11.2).

UNIÓN DE AMP CON NBD1 y 3

El AMP (activador metabólico de AMPK) interacciona con la Subunidad γ (Figura
6A), uniéndose principalmente en los sitios NBD1 y NBD3 e interaccionando
con aminoácidos catiónicos (como γR69, γR151, γH150, γK169, γH297, entre
otros) que estabilizan la carga negativa de su grupo fosfato (Figura 6B).

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Figura  6. A.  Estructura  de  la  Subunidad  γ  de  AMPK–β2  en  su  estado  activo.  B.
Ampliación  del  recuadro  rojo  donde  se  observa  la  unión  de  AMP  (verde)  en  las
regiones  NBD1  y  NBD3.  Se  indican  principalmente  los  aminoácidos  con  carga
positiva  (como  γR69,  γR151,  γH150,  γK169,  γH297)  que  estabilizan  el  grupo
fosfato  negativo  (-3PO4)  del  AMP.  Por  simplicidad  no  se  muestra  la  estructura
del  AMP  unida  al  sitio  NBD4  (PDB:  4EAI)  (Elaboración  propia,  Chimera  1.11.2).

UNIÓN DE ATP CON NBD1 y 3

El ATP (inactivador metabólico de AMPK) compite con el AMP para
interaccionar en los sitios NBD1 y NBD3 de la Subunidad γ. La comparación
estructural de la disposición de aminoácidos en NBD1 muestra que el ATP
produce un cambio conformacional importante en residuos catiónicos como

γH150, γR151 y γR69 (Figura 7A y B). Lo mismo ocurre con los residuos γK169
y γH297 de NBD3 (Figura 7C y D).

Ricardo Enrique Grados Torrez

Figura 7. Cambios conformacionales producidos por la unión de ATP en NBD1
y NBD3. La unión de ATP en NBD1 produce el desplazamiento y rotación de los
residuos de γH150, γR151 y γR69 (comparación entre

A y B). Mientras que en NBD3

produce desplazamientos en los residuos γH297 y γK169 (comparación entre

C y D).

Los cambios en la posición de los residuos por la unión de ATP se observan en celeste.
(AMP verde, ATP rojo). Por simplicidad se omitieron las estructuras secundarias y el
resto de aminoácidos. La localización de los dominios NBD1 a 4, fueron realizados
de acuerdo a los estudios de Oakhill et al., 2010 (PDB: 4EAI Subunidad γ unida a
AMP, PDB: 4EAK Subunidad γ unida a ATP) (Elaboración propia, Chimera 1.11.2).

PAPEL DE NBD3

El cambio conformacional que se produce en la Subunidad γ durante la
activación e inactivación de la AMPK, transfi ere la señal hacia las otras

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Subunidades mediante la interacción de γNBD3 con α-RIM2 (Subunidad α) y
con un Bucle C-terminal en βSD (Subunidad β), respectivamente (Figura 8A).
Ambas (α-RIM2 y el Bucle–βSD), repercuten en la confi guración de αAID y la

β-Hélice, esta última parece acoplarse al surco pequeño formado por αAID
(Figura 8B).

Figura 8. A. Cambios conformacionales de la subunidad γ (densidad electrónica
amarilla activa y celeste inactiva). NBD3 interacciona con α-RIM2 (lazo/gancho rojo) y
con un Bucle en βSD (anaranjado).

B. Una β-Hélice (región N-terminal de la Subunidad

β, anaranjado) interacciona con un surco pequeño formado por α-AID (densidad
electrónica roja) localizado en la Subunidad α (densidad electrónica verde) (PDB:
6B2E, PDB: 4EAK para la Subunidad γ inactiva) (Elaboración propia, Chimera 1.11.2).

REGIONES INVOLUCRADAS EN LA ACTIVACIÓN DE AMPK–β2

Las principales regiones de la AMPK–β2 se encuentran esquematizadas en la
Figura 9. La superposición de las densidades electrónicas de la Subunidad γ de
AMPK–β2 señala los cambios conformacionales globales que esta estructura
sufre tras su unión con ADP o ATP. Por otro lado, se observan diferentes regiones
con forma de bucles o lazos como α-RIM2 perteneciente a la Subunidad α y
un Bucle localizado en el Dominio de Interacción de Subunidades (SD) de la
Subunidad β, ambos, interaccionan muy próximos al NBD3 de la Subunidad

γ.  Adicionalmente,  se  señala  el  Lóbulo-N  que  forma  parte  del  Dominio
Catalítico (KD) y el α-AID con sus tres hélices (α1-3), ambos pertenecientes
a  la  Subunidad  α.  Una  hélice  extra  denominada  como  β-Hélice  localizada
en la región N-terminal de la Subunidad β, parece interaccionar con α-AID.
La estructura de SC4 en el sitio ADaM se encuentra muy próximo al residuo
fosforilado  βS108.  Finalmente,  puesto  que  la  estructura  corresponde  a  una
AMPK en su estado activo, el residuo αT172 presente en el bucle de activación
de la Subunidad α, se encuentra también fosforilado (Figura 9).

Ricardo Enrique Grados Torrez

Figura  9.  Estructura  trimérica  de  AMPK–β2.  Se  indican  todas  las  regiones  que
participan  en  la  dinámica  de  su  activación  e  inactivación  de  acuerdo  a  su  unión
con  moléculas  activadoras  como  SC4  y  AMP  o  inactivadoras  como  ATP.  En  la
subunidad  γ  se  observa  la  superposición  de  su  densidad  electrónica  en  estado
activo  (amarillo)  e  inactivo  (celeste)  evidenciando  sus  cambios  conformacionales
que  tienen  repercusión  en  el  resto  de  la  estructura  proteica  (PDB:  6B2E,  PDB:
4EAK  para  la  Subunidad  γ  inactiva)  (Elaboración  propia,  Chimera  1.11.2).

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Debido a que el músculo esquelético se encarga del consumo y almacenamiento
de la Glucosa, la acción de moléculas activadoras de la AMPK–β2 es de gran
interés clínico para mejorar su homeostasis en sangre (Dasgupta et al., 2012).
Estudios  recientes  indican  que  el  activador  SC4  actúa  de  forma  específi ca
sobre AMPK–β2 (que es la isoforma predominante en el músculo esquelético
humano) uniéndose al sitio ADaM de manera similar a muchos otros activadores
de  AMPK  (Wojtaszewski  et  al.,  2005;  Ngoei  et  al.,  2018).  La  especifi cidad
de  SC4  por  AMPK–β2  (EC

17,2 ± 1,6 nM) se debe principalmente a la

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interacción electrostática (puente salino) entre el átomo de Nitrógeno 4’ del
anillo -2(imidazolpirina) de SC4 y el residuo no conservado β2D111 del sitio
ADaM, aunque la sustitución del grupo 2-hidroxifenilo con estructuras basadas
en  ciclohexeno  sustituido  con  moléculas  polares  (compuestos  MSG010  y
MSG011) también mostraron selectividad para AMPK α2β2γ1 (Ovens et al.,
2022). Aunque esta interacción podría ser la única responsable de la potencia
y especifi cidad de SC4, el residuo β2R82 del Sitio ADaM también forma una
interacción  de  tipo  catiónica-π  con  el  mismo  anillo  que  podría  contribuir
en  la  especifi cidad  que  tiene  este  activador.  Por  tanto,  la  especifi cidad  del
sitio  ADaM  de  la  AMPK–β2  por  SC4  se  debe  esencialmente  a  sus  residuos
característicos y no así a su estructura global (Gu et al., 2018). A diferencia
de otros activadores como A-769662 (que actúan de forma sinérgica con el
AMP), estudios realizados en miotubos y hepatocitos de ratón indican que SC4
induce la activación de AMPK–β2 de manera independiente a la proporción
celular de AMP/ATP y a los cambios en la fosforilación de αT172 y βS108. Así,
SC4 actuaría directamente sobre el sitio ADaM estabilizando la estructura de
la AMPK–β2 en una confi guración activa (Bultot et al., 2016; Stephenne et al.,
2011; Ngoei et al., 2018).

Los  resultados  obtenidos  de  la  comparación  de  diferentes  estructuras
cristalográfi cas  de  la  AMPK  incluyendo  las  isoformas  β1  y  β2,  sugieren  un
modelo en la dinámica de su activación en el que participa la Subunidad γ como
un  sensor  de  la  proporción  AMP/ATP.  En  condiciones  de  défi cit  energético
(incremento  de  AMP/ATP),  el  AMP  primero  interacciona  con  NBD1  puesto
que  este  dominio  une  AMP  con  una  mayor  afi nidad  (x10)  en  comparación
con el ATP. La unión de AMP-NBD1 produce cambios conformacionales que
luego  son  transmitidos  al  resto  de  la  Subunidad  γ,  principalmente  a  NBD3
que es el que tiene menor afi nidad por AMP. La unión AMP-NBD3 también
podría  afectar  la  interacción  de  NBD4  por  AMP,  por  consiguiente,  es  muy
probable que la activación alostérica de AMPK dependa en primera instancia
de la identidad del nucleótido que ocupa NBD1 (Kurumbail and Calabrese,
2016). De esta manera y en concordancia con lo reportado por Oakhill et al.
(2010), se produce una “conversación cruzada” entre los NBDs que conlleva a
un cambio conformacional integral de la Subunidad γ. Esta señal de activación
a través de cambios conformacionales producidos por la unión de AMP en la
Subunidad γ tiene que ser posteriormente transferida al resto de Subunidades
(γ y β) de la AMPK.

El segmento regulador con forma de gancho α-RIM2 (365 – 371) de la Subunidad

α podría contactar directamente con NBD3 (detectando el estado de unión a
AMP o ATP) (Xiao et al., 2011; Chen et al., 2013) y comunicando así, la señal
de activación o inactivación al Dominio Catalítico (αKD). Si la señal es de
activación, α-RIM2 transmite la señal hacia el Bucle de Activación de αKD
(mediante los segmentos regulatorios fl exibles presentes en la Subunidad α)

Ricardo Enrique Grados Torrez

protegiendo así el residuo αPT172 de la acción de fosfatasas inactivadoras
(Iñiguez y Coutiño, 2008 y Kurumbail and Calabrese, 2016). Adicionalmente,
la señal de activación detectada por α-RIM2, también es transmitida hacia
la región trihelicoidal α-AID que experimenta una rotación importante de tal
manera que se aleja del Lóbulo-N localizado en el Dominio Catalítico (α-KD)
de la AMPK y se acerca a la Subunidad γ (Figura 9). De esta forma, el Lóbulo-N
puede mantenerse en una confi guración extendida permitiendo que la AMPK
se mantenga activa.

El Bucle–βSD también interacciona con la región NBD3 de la Subunidad γ,
enviando la señal de activación por AMP hacia una β-Hélice corta (en la región
N-terminal de la Subunidad β) que comprende los residuos βP60 a βS70. Esta

β-Hélice se ajusta a un surco poco profundo y abierto formado por α-AID.
La interacción de la β-Hélice parece mantener a α-AID en una confi guración
alejada del Dominio Catalítico (α-KD) de la AMPK. Por el contrario, cuando
la AMPK se encuentra en estado inactivo, α-AID se acerca e interacciona con
el Lóbulo-N promoviendo la apertura del Dominio Catalítico haciéndola más
susceptible a la acción de fosfatasas inactivadoras.

NBD3 es el sitio de unión a nucleótidos más débil en la Subunidad γ, sin embargo,
es  extremadamente  sensible  a  los  cambios  en  los  niveles  de  nucleótidos  y
esto  permite  que  AMPK  responda  rápidamente  a  las  variaciones  del  estado
energético  de  la  célula.  Por  el  contrario,  moléculas  activadoras  como  SC4
interaccionan con AMPK en el sitio AdaM independientemente del estado de
fosforilación de T172, S108 y del estado de unión de los NBDs en la Subunidad

γ. Actúan directamente promoviendo un cambio conformacional activo y
estabilizando esta confi guración con un Dominio Catalítico activo. El estudio
de este modelo de activación es muy importante para poder diseñar, extraer
e identifi car compuestos activos de fuentes naturales que tengan propiedades
de especifi cidad y potencia similar a SC4 u otros activadores sintéticos, para
poder emplearlos como tratamientos alternativos de enfermedades metabólicas
como la Obesidad y DM2 que afectan enormemente a nuestra población.

AGRADECIMIENTOS

A la Fundación Internacional para la Ciencia (International Foundation for
Science: IFS) Estocolmo, Suecia.

DOI: https://doi.org/10.53287/oxwp5437kk73d

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