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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 2 (2014) 125-138
Amplificación isotérmica mediada por LOOP (LAMP) de ácidos nuclecios en el diagnostico clínico
SÁNCHEZ, EDWIN1 NINA, MARITZA1 AGUIRRE, PAMELA1 ARCE, MAYRA1 TORO, NEYDA1 VILELA, RODRIGO1
FECHA DE RECEPCIÓN: 16 DE ABRIL DE 2014 FECHA DE ACEPTACIÓN 30 DE JULIO DE 2014
Abstract
As technology develops, the microor- ganisms are also increasing their ability to become more virulent antibiotic resistant generation; routine tests Polymerase Chain Reaction (PCR) are tools that help us in the clinical diagnosis but a major disadvantage is its high cost due to equipment using the length and where it can deliver results. It is therefore advisable to use rapid, sensitive and specific methods to help us in the diag- nosis of infectious diseases. A novel meth- od currently used in developed countries
is Mediated Isothermal Amplification Loop (LAMP) Nucleic Acids. LAMP provides re- sults in less time with high sensitivity and specificity, thus necessitating a water bath operating at a single temperature of 60°C to 65°C, 4 and 6 primers at least maximum all highly specialized, DNA polymerase is
1 Estudiantes de 4to año de la Carrera de Bioquímica FCFB – UMSA
the Bst polymerase activity which is dis- placing string comes from Bacillus stearo- thermofilus; in case of amplifying RNA us- ing a reverse transcriptase is made; the results can be seen with the naked eye due to haze that forms after the reaction, can also be used as reagents calcein (fluores- cence visual method), CYBR green, giving a coloration when the reaction becomes positive . Countries that are developing are
the worst sufferers of microorganism infec- tions, one of the reasons given by poverty and poor diet and LAMP still a good option to incorporate as routine tests in the labo- ratory due to it's low cost and simplicity in terms of equipment
KEY WORDS
amplification, isothermal, LAMP, primer, loop, infectious diseases
La desventaja de los países en vías de desarrollo, es que las personas están predispuestas a contraer enfermedades infecciosas ocasionadas por microor- ganismos esto debido a la mala alimentación, la pobreza, el alcoholismo, las drogas. En estos países es muy difícil tener los equipamientos de última gene- ración para el buen diagnóstico clínico.
Las pruebas de rutina como el cultivo y la microscopia siguen siendo mé- todos tradicionales que se usan en el laboratorio, si bien nos brindan resulta- dos confiables estos lo hacen en un tiempo muy extenso. Además existen pa- tógenos que no se los puede cultivar y si se puede tienen un desarrollo muy lento lo cual hace que se limite el diagnostico.
La observación directa de los microorganismos (parásitos, bacterias, hon- gos) por microscopía es con frecuencia empleado como método de diagnós- tico rápido y sencillo. La robustez y relación costo - eficiencia de las pruebas
microscópicas hacen que sean aceptables para su uso incluso en laboratorios con recursos limitados en los países en desarrollo. Sin embargo, la poca sen- sibilidad de la prueba puede llegar a tener consecuencias muy graves; la in- fección viral también ha sido diagnosticada por cultivo selectivo, seguida por la observación en microscopía electrónica. Un gran inconveniente es el tiem- po que tarda y por ende inicio tarde del tratamiento. De acuerdo con ello se requieren métodos de diagnósticos rápidos, sensibles y específicos que ayu- den al buen diagnóstico.
Métodos moleculares como la Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR
), Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR ), Amplificación Basada en Secuencias de Ácidos Nucleicos (NASBA), y Amplificación por Desplazamiento de Cade- na (SDA) se comercializan en forma de kits y es introducido en el diagnósti- co de rutina lo cual brinda una mayor garantía de obtener buenos resultados. (Yasuyoshi Mori, Tsugunori Notomi 2009).
En el año 2000, Notomi y colaboradores, publicaron un estudio sobre una nueva prueba molecular llamada LAMP, que consiste en la amplificación de ácidos nucleicos en condiciones isotérmicas. El protocolo de laboratorio para aplicar LAMP acaba de ser examinado y los autores insisten en que, como la señal química de reconocimiento es altamente sensible, el sistema permi- te la discriminación visual de resultados sin equipos especializados costosos. La empresa Eiken Chemical Company, Ltd. es líder actual en la tecnología de LAMP. (Arroyo, M. I. et al. 2008)
Amplificación Isotérmica Mediada por loop (LAMP) de ácido nucleico am- plifica el DNA blanco con alta especificidad, eficacia y rapidez bajo condicio- nes isotérmicas, que se lleva a cabo a una temperatura constante (entre 60 °C
- 65 °C), utiliza una Bst polimerasa con actividad desplazante de cadena. En la tabla N° 1 se muestran las propiedades de LAMP.
Tabla n° 1 Propiedades del método LAMP
Simplicidad | Amplificación isotérmica en un solo paso Detección visual de productos amplificados |
Rapidez | Resultados de las pruebas finales entre 15 a 60 minutos |
Especificidad | Uso de 4 cebadores que reconocen 6 regiones distintas del DNA blanco Amplificación -Resultados positivos de la prueba |
Rentabilidad | No requiere ningún reactivo especial y equipo sofisticado |
Productos amplificados | Cantidad extremadamente grande (109-1010 veces dentro de 15 a 60 minutos) Diversos tamaños de las estructuras de repeticiones invertidas de forma alterna de la secuencia diana en el misma cadena |
Amplificación de RNA | Amplificación isotérmica de RNA en un solo paso con sólo añadir la transcriptasa inversa |
(Fuente de la información anterior: Eiken Chemical Co., Ltd. LAMP folleto)
La principal ventaja de LAMP en comparación de la PCR y otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos es que no requiere termocicladores, ya que puede llevarse a cabo en dispositivos de calefacción simples tales como baño maria o bloque de calor de laboratorio. (Oriel M. M. Thekisoe and No- boru Inoue 2011). En la tabla N° 2 se muestras las diferencias que tiene LAMP con otros métodos que también son usados en el diagnóstico clínico.
Tabla n° 2:
Comparación entre diversas tecnologías de amplificación de ácido nucleico
(Fuente: Tomada con modificaciones de Gill y Ghaemi, 2008)
Para llevar a cabo la reacción de LAMP se necesitan un numero de 4 has- ta 6 cebadores; 2 cebadores externos F3 y B3, 2 cebadores internos FIP (F1C, F2) y BIP (B1C, B2) que tienen secuencias tanto sentido y antisentido de tal manera que ayuda en la formación de un bucle, 2 cebadores bucle F(FLP) y B(BLP) diseñados para acelerar el reacción de amplificación mediante la unión adicional a sitios que no son accesibles por los cebadores internos. Re- conociendo un total de 8 secuencias distintas del DNA blanco (Figura N°1) to- dos estos cebadores son los que le dan la especificidad al método.
Los cebadores internos se denominan Forward Inner Primer (FIP) y Bac- kward Inner Primer (BIP), respectivamente, y cada uno contiene dos secuen- cias distintas que corresponden a las secuencias sentido y antisentido del ADN blanco, uno para cebar en la primera etapa y el otro para auto-cebarse en etapas posteriores. Las secuencias (23-24 nucleótidos típicamente) dentro
de ambos extremos de la región blanco para la amplificación en un ADN son denominadas F2c y B2, respectivamente. Dos secuencias internas (23-24 nu- cleótidos típicamente) a 40 nucleótidos de los extremos de F2c y B2 son de- signadas F1c y B1 y dos secuencias (17-21 nucleótidos) externas a los extre- mos de F2c y B2 son denominadas F3c y B3. Las secuencias de FIP y BIP son diseñadas así: FIP contiene F1c, un espaciador de TTTT y la secuencia F2 com- plementaria a F2c. BIP contiene la secuencia B1c complementaria a B1, un es- paciador de TTTT y a B2. Los dos cebadores externos consisten en B3 y la se- cuencia F3 complementaria a F3c. (Arroyo, M. I. et al. 2008)
El contenido de GC de los cebadores debe ser aproximadamente del 50- 60% y alrededor de 40-50 % para AT. Los cebadores deben ser diseñados de manera que no se forme fácilmente estructuras secundarias. La secuencia del extremo 3' no debe ser rica en AT o complementarias de otros cebadores. La distancia entre el extremo 5' de F2 y B2 debería ser 120 - 180pb, y la distancia entre F2 y F3 así como de B2 y B3 debe ser 0-20pb. La distancia para las regio- nes de formación de bucle (5' de F2 a 3' de F1, 5' de B2 a 3' de B1) debe ser 40-60pb. (Parida, M. et al. 2008)
Figura n° 1
Representacion esquematica de los cebadores usados en LAMP, FLP y BLP son usados en LAMP en tiempo real (mejora de LAMP)
(Fuente: Reviewls in Medical Virology Parida, M., 2008)
Figura N° 2
Secuencias de cebadores de Plasmodium Falciparum los cebadoeres fueron extraidos de (GenBank accessionno. M19173.1)
REGIÓN | PRIMER SEQUENCE (5' to 3') |
F1P(F1c+F2) | AGCTGGAATTACCGCGGCTGGGTTCCTAGAGAAACAATTGG |
B1P(B1+B2c) | TGTTGCAGTTAAAACGTTCGTAGCCCAAACCAGTTTAAATGAAAC |
F3 | TGTAATTGGAATGATAGGAATTTA |
B3c | GAAAACCTTATTTTGAACAAAGC |
LPF | GCACCAGACTTGCCCT |
LPB | TTGAATATTAAAGAA |
Fuente: Clinical Chemistry (Leo L.M. Poon et al. 2005)
Se lleva a cabo en dos pasos: no cíclico y cíclicos. Extraido de (Ushikubo H. Principle of LAMP method—a simple and rapid gene amplification method. Uirus 2004; 54(1): 107–112.)
NO CÍCLICO .- Los cebadores inician su acción en dirección 5'3', el pri- mer cebador en interactuar con el DNA blanco es el FIP el cual se une a su región complementaria F2c y así comienza a sintetizar la hebra complemen- taria del DNA blanco (figura 3A), el siguiente cebador en interactuar es el F3 uniéndose a la región F3c complementaria del DNA blanco, la Bst polimera- sa tiene una cualidad, esta actúa también como helicasa lo que ocasiona que la doble hebra se abra y la F3 pueda seguir con su camino; por el otro extre- mo tanto BIP como B3 siguen los mismo paso, la hebra complementaria sim- ple cadena hace que por complementariedad sus extremos formen un loop o buble esta hebra es la que servirá como secuencia madre para la posterior síntesis de DNA.
Figura 3A.
Principios de la amplificación de la LAMP. Generación de DNA tallo bucle estructura con forma de mancuerna en ambos extremos a la cual denominamos secuencia madre; está listo para entrar en etapa de amplificación cíclica
Derechos de autor # 2005, Eiken Chemical Co. Ltd., Japón
CICLIZACIÓN.- (figura 3B) En la secuencia madre, interactúan nuevamen- te el cebador FIP donde la región F2 se una a su región F2c de la hebra com- plementaria realizando la hibridación así como también por el otro extremo BIP donde la región B2 se une a su región B2c de la hebra complementaria, en el transcurso de la polimerización las secuencias sintetizadas van adqui- riendo una forma de coliflor.
Figura 3B
El producto son las estructuras de diferente tamaño que consisten en repeticiones de la secuencia balnco, dando una estructura similar a una coliflor.
Derechos de autor # 2005, Eiken Chemical Co. Ltd., Japón
Los cebadores bucle tanto FLP como BLP son los que se utilizan en LAMP EN TIEMPO REAL la cual brinda las primeras señales a los 11 minutos de ini- ciada la reacción (K. Nagamine, T. Hase and T. Notomi 2002) (figura 4)
Figura 3C
Los cebadores bucle Proporcionan sitios de partida adicionales para la síntesis de DNA y acelerar la amplificación reduciendo el tiempo de reacción a menos de 30 minutos.
Derechos de autor # 2005, Eiken Chemical Co. Ltd., Japón
Figura 4
Grafica absorbancia vs. Tiempo los círculos abiertos iundican que usaron cebadores bucle FLP Y BLP. Los triangulos abiertos y circulos cerrados indican que no usaron los cebadores bucle. Se amplifico DNA de Virus de Hepatitis B
Derechos de autor # 2005, Eiken Chemical Co. Ltd., Japón
Para mejor comprensión del mecanismo de LAMP puede visitarse la pági- na electrónica: vimeo.com/13391184
Se lleva a cabo mediante Transcripción Inversa (RT -LAMP) donde además de los reactivos de DNA para la amplificación (cebadores, ADN polimera- sa con actividad de desplazamiento de hebra, sustratos, etc ) se añade trans- criptasa inversa . La detección se puede llevar a cabo en un solo paso. (Pari- da, M. et al. 2008)
LAMP utiliza Bst polimerasa con temperaturas óptimas oscilan entre 60 - 65ºC y se inactiva a 80ºC. Aunque la temperatura de almacenamiento reco- mendada es – 20ºC, la Bst polimerasa es relativamente estable fuera de la ca- dena de frío durante más de 14 días. La Tabla 3 muestra las características de ADN polimerasa Bst en comparación con la ADN polimerasa Taq que es am- pliamente utilizado en la PCR.
Tabla Nº 3
Características de la Bst polimerasa y Taq polimerasa
PROPERTY | Bst DNA Polymerase | Taq DNA Polimerase |
Origin | Bacillus stearothermofilus | Thermus aquaticus |
DNA poly | 5' 3' | 5'3' |
Primer | Required | Required |
Strand displacement | Yes | No |
DNAdenaturation step | Not required | Required |
Reaction temp. | 65°C | 75°C |
Heat inactivation | 80°C | None |
Fuente Oriel M. M. Thekisoe and Noboru Inoue 2011
(Hidekazu Takagi, Makoto Itoh, Mohammad Zahidul Islam, et al. 2009 en su artículo Sensitive, Specific, and Rapid Detection of Leishmania donova- ni DNA by Loop-Mediated Isothermal Amplification) trabajan con parásitos del genero de Leishmania. Para determinar la sensibilidad diluyen una serie de muestras de DNA de L. donovani que va de 100pg a 1fg de concentración, el producto de amplificación se detectó en todas las muestras (Figura 5A y B )
. Por el contrario, con el PCR convencional, la muestra 1fg era demasiado dé- bil para ser juzgado positivo o negativo (Figura 5C carril 6). La PCR anidada mostró un reacción positiva en 100pg hasta 1fg (Figura 5D). Evaluando la sen- sibilidad de la LÁMP, 20-25 alícuotas con 1fg, 20 (80 %) de 25 alícuotas fueron positivos. Con 100pg, 1 (5 %) de 20 eran positivo. En un experimento similar usando una PCR convencional, 1(7 %) de los 15 resultados de la prueba fue positiva con 1fg de DNA del parasito. La PCR anidada amplificada 11 (55 %) de 20 muestras con 1fg, pero ninguno de los 20 con 100pg . Estos resultados indicaron que nuestra LAMP fue más sensible que la PCR anidada.
Figura Nº5
Sensibilidad a. Deteccción de LAMP por turbidez. b. LAMP c. PCR convencional d. PCR anidado
Figura Nº6
ESPECIFICIDAD, usaron diferentes especies de Leishmania A. LAMP -POSITIVO SOLO PARA L. donovani
B. PCR CONVENCIONAL-POSITIVO PARA TODAS LAS ESPECIES de Leishmania C. PCR ANIDADO – POSITIVO SOLO PARA L. donovani
Para evaluar la especificidad de LAMP, fueron examinados las muestras de DNA de las otras cinco especies de Leishmania (L. infantum, L. major, L. mexi- cana, L. tropica, y L. braziliensis ). Cuando se usó 100ng de ADN para cada muestra de Leishmania, el producto de amplificación no fue detectado (Figu- ra 6A). El mismo resultado se obtuvo con la PCR anidada (Figura 6C). Varios productos de amplificación fueron detectados con la PCR convencional, pero tenían inesperado tamaños (Figura 6B, carriles 2-6). Estos resultados mostra- ron que la LAMP era específico para la detección de L. donovani.
Figura 7
Detección de LAMP por turbidez, esto se debe a que el pirofosfato el cual se forma como producto secundario de la amplificación reacciona con el magnesio, haciendo que el medio se vuelva turbio. La PCR solo se detecta mediante corrida electroforética.
Fuente Leo L.M. Poon, et al. (2006). pp 303-306
La calceína en el reactivo de detección fluorescente de LAMP fue combi- nada inicialmente con iones de magnesio para conseguir el efecto de amorti- guación. La amplificación genera el subproducto, iones pirofosfato, los cuales se unirán y quitarán iones manganeso de la calceína para irradiar fluorescen- cia. La fluorescencia es intensificada mucho más a medida que la calceína se combina con los iones magnesio. En consecuencia, la presencia de fluores- cencia puede indicar la presencia del gen blanco y la detección visual pue- de lograrse.
Figura 8
Detección visual mediante luz UV, para ello se usa un colorante fluorescente como el bromuro de etidio entre otros.
Fuente:Adams, E. R., et al.(2010). 591–596
Se hace uso de geles de agarosa para separar los productos de amplifica- ción obtenidos.
PCR convencional | PCR en tiempo real | LÁMP | |
VENTAJAS | Estándar de oro alternativo para el aislamiento en ausencia de agente en vivo | amplificación simultánea y la detección durante exponencial amplificación | amplificación del gen sin requerir termociclador |
confirmación temprana diagnóstico | Monitoreo en tiempo real de la amplificación | La amplificación puede ser logrado con baño de maria / bloque de calentamiento | |
formato de diagnóstico molecular ampliamente utilizado | Cuantitativo, por tanto útiles para el seguimiento de la carga viral | En tiempo real, así como cuantitativo | |
Se trabaja en tubo cerrado debido a contaminación | Altamente sensible y especifico | ||
Aumento de la sensibilidad debido a la química fluorescente | Simple vista visual monitoreo ya sea a través de la turbidez o cambio de color por intercalante fluorescente colorante (SYBR Green I ) | ||
Alto rendimiento análisis debido al software operación impulsada | |||
DESVENTAJAS | Cualitativa (Sí o No formato ) | detección de caro equipos y consumibles | diseño complicado de cebadores (requisito para seis cebadores ) |
Detección de punto final en fase de meseta | Requisito para sonda fluorescente | Dos largos cebadores de Pureza de grado HPLC | |
Manejo post-PCR líder para llevar a más de contaminaciones | Restringido a laboratorios que no tengan buen apoyo financiero | Restringido a la disponibilidad de reactivos y equipos en algunos países | |
Menos sensible, de ese modo faltan casos límite con bajo número de copias de genes números | |||
Consume tiempo (3-4 horas ) | |||
Requisito para termociclador y gel sistema de documentación |
Fuente: JOHN WILEY & SONS, Ltd. 2008
LAMP es un método que fue estudiado por Notomi et al. el año 2000. A partir del cual surgieron muchas investigaciones tanto en el diagnostico clínico en animales (Ikadai, H., Tanaka, H., et al.(2004) Molecular Evidence of Infections with Babesia gibsoni Parasites in Japan and Evaluation of the Diagnostic Potential of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method. American Society for Microbiology 42 (6) 2465–2469) como en humanos, tambien se realizaron estudios a nivel de enfermedades infecciosas causadas por alimentos (Ohtsuka K., Yanagawa K., et al. Detection of Salmonella ente- rica in naturallycontaminated liquid eggs by loop-mediated isothermal am- plification, and characterization of Salmonella islotes appl Environ microbiol
(71) 2005 6730.6735) indican que no se inhibio la reacción con los componen- tes que tiene el huevo, un caso contrario a este (Wang, D., Huo, G., Wang, F., Li, Y. and Ren, D. Drawback of loop-mediated isothermal amplification 083- 086 (2008).) indican que si no se usa el kit para la extracción del DNA de Sall- monella la LAMP sale menos sensible y contrariamente si se usa el kit sale al- tamente sensible.
Boehme, C. C.,et al. (2007) pp1936–1940 menciona que la prueba es tan facil de realizar que hasta un técnico sin conocimiento la podria realizar, tam- bien indica que los inhibidores presentes en la sangre no afectan en la reacción y asi refuerza sus resultados con ( Poon et al. 2005) que trabajo con Malaria.
Iwamoto, T., Sonobe,T. and Hayashi, K. (2003) 2616–2622 mencionan que las especies de Micobacterias se pueden identificar en 35 min de un cultivo en medio sólido y en 60 minutos a partir de un cultivo en medio líquido o de esputo muestra de análisis tras la extracción de DNA, concluyen que en el cal- do de MGIT usado como medio liquido el numero de células seria minimo al del cultivo en medio solido.
Como ya se habia mencionado antes los inhibidores presentes en dife- rentes tipos de muestra de alguna forma no afectan a la reacion de LAMP, y debido a la temperatura que se usa ocaciona la formacion de pirofosfato la cual reacciona con el ion magnesio y como consecuencia un medio turbio, en caso de la PCR esto no sucede debido a que el pirofopsfato es hidroliza- do a 94ºC.
Relacionando con otros metodos LAMP es el método mas efectivo, si bien muestra igualdad de resultados en cuanto a la PCR nested y la PCR en tiempo real estos métodos son de alto costo y seria muy dificil acoplarlos a paises que se encuentran en vias desarrollo recordando que estos paises son los que mas sufren de enfermedades infecciosas; la utilización de tan solo un baño ma- ria para LAMP hace que podamos optimizar el método en nuestro medio,en Gen Bank ya existen diseños de cebadores para diferntes microorganismos y virus lo cual facilita la incorporacion a un laboratorio.
Sánchez, E. y Col. / Revista Con-ciencia N°1/Vol. 2 (2014) 125-138
Zablon Kithinji Njiru, Andrew Stanislaw John Mikosza, Tanya Armstrong, John Charles Enyaru, Joseph Mathu Ndung’u, Andrew Richard Christopher Thompson (2008). Loop-Mediated Isothermal Amplifica- tion (LAMP) Method for Rapid Detec- tion of Trypanosoma brucei rhodesiense [versión electrónica]. PLOS Neglected Tropical Diseases 2, Retrieved from www.plosntds.org