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REVISTA CON-CIENCIA N°1/VOL. 2 (2014) 101-114
Desarrollo de un metodo analitico indicador de estabilidad y biodisponibilidad en vitro por hplc para microencapsulado de acido acetilsalicilico y cafeina
CORRESPONDENCIA: CRISTIANDR@LIVE.COM
FECHA DE RECEPCIÓN: 16 DE ABRIL DE 2014 FECHA DE ACEPTACIÓN 30 DE JULIO DE 2014
Abstract
Is developing a stability indicator and biodisponobilidad analytical method by HPLC ( High Resolution Liquid Chroma- tography ) for the determination of acetyl- salicylic acid and its degradation product Salicylic Acid plus the determination of caf- feine in a solid dosage form in this case a granules . To establish the validity of the an- alytical method parameters specificity, lin- earity and range, precision, accuracy, limit of quantification and limit of detection us- ing a liquid chromatograph Agilent High Resolution HPLC, column chromatography with silica-based chemically bonded were determined a hydrocarbon chain of 18 car- bon atoms, L1 according to USP ( United States Pharmacopeia ) a mobile phase com- posed of 85% monobasic sodium phos- phate adjusted to a concentration of 25
1 Laboratorio de Control de Calidad de Medicamentos FCFB-UMSA
mM at pH 2.4 and 15% HPLC grade aceto- nitrile, this method was used for the quan- tification of acetylsalicylic acid and Caf- feine granules containing mannitol, alcohol, FD & C Yellow No. 6, saccharin, flavor or- ange spray, sodium bicarbonate, citric acid, copovidone, copolymer of meta acrylic acid as an agent for enteric coating. Bioavailabil- ity vitro micro encapsulated aspirin with enteric coating agent and in addition to caffeine which was evident that the analyti- cal method is the ability to quantify these active ingredients in a first step subject-
ed two hours gastric fluid was then deter- mined simulated and from there an hour in simulated intestinal fluid in vitro dissolution equipment Pharma Test
KEY WORDS
validation, bioavailability, stability, HPLC
La tematica actual “Validacion de Metodologias Analiticas Indicadoras de Estabilidad y Biodisponibilidad” tiene una importancia fundamental en el area de la produccion y control de calidad de los medicamentos, la USP (Farmaco- pea de los Estados Unidos) refiere metodos para el analisis de los principios activos que tienen ciertas particularidades que hacen dificultosa su repro- duccion en otros paises como en Bolivia, por ello se dessarrollo un metodo Analitico Indicador de Establidida y Biodisponibilidad en el Laboratorio de Control de Calidad de Medicamentos de la Facultad de Ciencias Farmaceuti- cas y Bioquimicas de la Universidad mayor de San Andres.(USP.2009:1730-31)
La estabilidad de medicamentos es la extension del tiempo en el que un producto farmaceutico terminado mantiene entre limites especificados las mismas propiedades que tenia en el momento de su manufactura (propieda- des fisicas, quimicas, microbiologicas, biofarmaceuticas, fisicoquimicas, tera- peuticas y toxicologicas) despues de un proceso de manufactura definido y en un envase primario y secundario.(OMS,Informe 43.2009.anexo 4)
En el caso del Ácido Acetilsalicílico se requiere de un método analítico va- lidado con la capacidad de cuantificar a este principio activo y su producto de degradación el Ácido Salicílico como se muestra en la siguiente imagen: (Connors, K.A.1986. pp:8-12)
Los parámetros fundamentales para la Validación de un método Analíti- co los siguientes:
Especificidad y Selectividad
Linealidad e Intervalo de Análisis
Precisión
Exactitud
Límite de Detección y Limite de Cuantificación(Quattrochi, O.A.1992. pp:107-20)
Es la pertinencia del instrumento para detectar un analito. (Quattrochi, O.A.1992.)
Capacidad de un método analítico para identificar y/o cuantificar simul- tánea o separadamente los analitos de interés de manera inequívoca en pre- sencia de otras sustancias químicas que puedan estar presentes en la mues- tra. (Quattrochi, O.A.1992.)
Capacidad del Método de proporcionar resultados que son directamente (o por medio de transformaciones matemáticas) proporcionales a la concen- tración del analito dentro de un intervalo establecido. (Quattrochi, O.A.1992.)
Capacidad del método de tener concordancia (menor grado de disper- sión) entre una serie de datos de tomas múltiples a partir de una misma muestra(Quattrochi, O.A.1992.)
Capacidad del Método Analítico de expresar la proximidad del valor acep- tado convencionalmente como verdadero o un valor de referencia, con el va- lor experimentalmente encontrado. (Quattrochi, O.A.1992.)
Dentro de la sensibilidad se encuentran el Límite de Detección y Límite de Cuantificación que se definen de la siguiente manera: (Quattrochi, O.A.1992.)
La mínima cantidad de analito en la muestra que se puede cuantificar bajo las condiciones experimentales descritas con una adecuada precisión y exactitud(Quattrochi, O.A.1992.)
La mínima cantidad del analito en la muestra que se pueda detectar aun- que no necesariamente cuantificar bajo las condiciones Experimentales del Método Analítico. (Quattrochi, O.A.1992.)
Desarrollar un Método Analítico indicador de Estabilidad y Biodisponibi- lidad para el Ácido Acetilsalicílico por cromatografía liquida de alta resolu- ción (HPLC)
MATERIALES y REACTIVOS | METODOS |
in vitro |
Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución Agilent
Equipo de Disolución in vitro Pharma Test
Filtros de Acetato de Celulosa de un micronaje de 0,22 μm
Material de vidrio típico de laboratorio
Acetonitrilo HPLC
Fosfato monobásico de sodio P:A.
Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC)
Disolución de Formas Farmacéuticas Solidas
Sonicacion Ultrasonido
Ultrafiltración
El método analítico esta relacionado con las directrices de “Introducción a la HPLC” el cual da el soporte técnico científico para el desarrollo de méto- dos analíticos indicadores de estabilidad y biodisponibilidad.
Se utilizaron Ácido Acetilsalicílico, ácido Salicílico y Cafeína Anhidra Es- tándares de trabajo de referencia obtenidos por normalización interna.
Longitud de Onda: 215nm
Fase Móvil: Mezcla Filtrada por 0.45 micrómetros con la siguiente com- posición:
85% de un solución amortiguadora de Fosfato Monobásico de Sodio (NaH2PO4) a una concentración 25mM ajustado con Ácido Fosfórico a pH=2.4
15% de Acetonitrilo (ACN)
Diluyente: Fase móvil
Fase Estacionaria: Columna Cromatográfica C18 base de Silica unida a una Cadena Hidrocarbonada de 18 átomos de carbono (L1 según USP).
Flujo: 2ml/min
Volumen de Inyección: 20 microlitros(Quattrochi, O.A.1992.)
Imágenes de los espectros de absorcion del acido actetilsalicilico y la cafeina
Fuente: propia, 2001
Imagen del cromatograma de los estandares de acido acetilsalicilico, cafeina y acido salicilico
Fuente: propia, 2001
Tabla que muestra los parametros cromatograficos para establecer la selectividad del método analitico
Fuente: propia, 2001
El método es SELECTIVO ya que la resolución entre los picos del Ácido Acetilsalicílico la Cafeína y el Ácido Salicílico tienen un valor mayor a 2.
Además el Método Analítico es Indicador de Estabilidad ya que puede Analizar de manera separada al producto de degradación del Ácido Acetil- salicílico.
Tabla que muestra los datos de linealidad
x (ug/mL) | y (Abs.) | x² | y² | xy | f((y-a)/x) | s² |
150 | 3279.9100 | 22500.000 | 10757809.61 | 491986.50 | 20.29 | 0.029 |
150 | 3330.8700 | 22500.000 | 11094694.96 | 499630.50 | 20.63 | |
150 | 3305.3900 | 22500.000 | 10925603.05 | 495808.50 | 20.46 | |
225 | 4838.8800 | 50625.000 | 23414759.65 | 1088748.00 | 20.46 | 0.004 |
225 | 4866.9400 | 50625.000 | 23687104.96 | 1095061.50 | 20.58 | |
225 | 4852.9100 | 50625.000 | 23550735.47 | 1091904.75 | 20.52 | |
300 | 6299.2600 | 90000.000 | 39680676.55 | 1889778.00 | 20.21 | 0.004 |
300 | 6335.5200 | 90000.000 | 40138813.67 | 1900656.00 | 20.33 | |
300 | 6317.3900 | 90000.000 | 39909416.41 | 1895217.00 | 20.27 | |
375 | 7885.1600 | 140625.000 | 62175748.23 | 2956935.00 | 20.40 | 0.000 |
375 | 7881.8000 | 140625.000 | 62122771.24 | 2955675.00 | 20.39 | |
375 | 7883.4800 | 140625.000 | 62149256.91 | 2956305.00 | 20.39 | |
450 | 9441.1100 | 202500.000 | 89134558.03 | 4248499.50 | 20.45 | 0.000 |
450 | 9450.3300 | 202500.000 | 89308737.11 | 4252648.50 | 20.48 | |
450 | 9445.7200 | 202500.000 | 89221626.32 | 4250574.00 | 20.46 | |
∑x | ∑y | ∑x² | ∑y² | ∑xy | n | |
4500 | 95414.67 | 1518750 | 677272312.2 | 32069427.8 | 15 |
Fuente: propia, 2001
Fuente: propia, 2001
a = | 236.486 | r = | 0.999917782 | |
b = | 20.41497333 | r² = | 0.999835571 |
Fuente: propia, 2001
Tabla del test de hipótesis para la pendiente (b)
H(O) = | b = 0 | H(1) = | b ≠ 0 |
S²xy = | 889.7067362 | Sb = | 0.072610855 | |||
t(0.05,n-2) = | 2.16037 | texp = | 281.15594 | Conclusión = | Se rechaza H(o) | |
Límites de Confianza = | bmáximo = | 20.572 | bmínimo = | 20.258 | ||
Fuente: propia, 2001
Tabla del test de hipótesis para la ordenada en el origen (a)
H(O) = | a = 0 | H(1) = | a ≠ 0 | |||
Sa = | 23.10463247 | |||||
t(0.05,n-2) = | 2.16037 | texp = | 10.23544 | Conclusión = | Se rechaza H(o) | |
Límites de Confianza = | amáximo = | 286.401 | amínimo = | 186.571 | ||
Fuente: propia, 2001
Tabla del análisis de varianza para la regresión lineal
Sxx = | 168750 | Sxy = | 3445026.75 | SCr = | 70330129.2 |
∑(∑yi)² = | 2031809743.4 | SCep = | 2397.6854 | SCec = | 70339297.7 |
SCl = | 9168.5 | SCE = | 11566.2 | ||
Fv | gl | SC | CM | Fexp | Ft |
Regresión | 1 | 70330129.23 | 70330129.23 | 79048.6644 | 4.667 |
Error | 13 | 11566.1876 | 889.7067362 | CONCLUSION | b≠ 0 |
Total | 14 | 70341695.4 |
Fuente: propia, 2001
Los resultados evidencian que el Método Analítico es LINEAL en el inter- valo de concentraciones Establecido.
Se trabajó con soluciones estándar en concentraciones de 150, 300 y 450 microgramos por mililitro de Cafeína y se obtuvieron los siguientes resultados.
Tabla que muestra repetibilidad del método
% | X (ug/ml) | Y (Area) | f = Y/X |
50 | 150 | 3427.9300 | 22.85287 |
50 | 150 | 3041.2600 | 20.27507 |
50 | 150 | 3234.5950 | 21.56397 |
100 | 300 | 6528.4000 | 21.76133 |
100 | 300 | 6549.8600 | 21.83287 |
100 | 300 | 6539.1300 | 21.79710 |
150 | 450 | 9547.9400 | 21.21764 |
150 | 450 | 9518.6600 | 21.15258 |
150 | 450 | 9533.3000 | 21.18511 |
Promedio de f = | 21.51539 | ||
s = | 0.69818 | ||
CV (%) = | 3.25 | ||
Conclusión= | Repetibilidad del Método Aceptable | ||
Fuente: propia, 2001
CV Teórico menor a 6.71%
El Coeficiente de Variación obtenido de los factores de respuesta es de 3.25% menor al Coeficiente de variación Teórico que es 6.71% por lo que se concluye que el método es PRECISO.
Se prepararon soluciones Estándar y Muestra de concentraciones de 50 a 150%(21)
Principio Activo Puro
Muestra que contiene al principio Activo
CONCENTRACIONES | 50%-100%-150% |
GRUPOS | M vs ST |
Fuente: propia, 2001
Tabla que muestra los datos de las concentraciones y sus respuestas
x (ug/mL) | ESTANDAR (datos linealidad) | ||
150 | 3279.9100 | 3330.8700 | 3305.3900 |
300 | 6299.2600 | 6335.5200 | 6317.3900 |
450 | 9441.1100 | 9450.3300 | 9445.7200 |
x (ug/mL) | MUESTRA (datos precisión) | ||
150 | 3427.9300 | 3041.2600 | 3234.5950 |
300 | 6528.4000 | 6549.8600 | 6539.1300 |
450 | 9547.9400 | 9518.6600 | 9533.3000 |
Fuente: propia, 2001
Recuperación media
Ensayo 1 (%) | Ensayo 2 (%) | Ensayo 3 (%) | |
Nivel 1 | 65.3206 | 57.0658 | 61.1614 |
Nivel 2 | 103.6376 | 103.3831 | 103.5100 |
Nivel 3 | 126.4144 | 125.9038 | 126.1590 |
Promedio = | 96.9506 | CV (%) = | 29.5381 |
Fuente: propia, 2001
texp =0.31
t (95%,n-1) =2.306
El Método Analítico es Exacto ya que el valor de t de Student Experimen- tal es menor que el valor Estadístico de Tablas.
Resultados del Límite de Detección y Limite de Cuantificación (Pérez, J.A. y Forn M.P 2001.pp: 45-94)
Fuente: propia, 2001
Imagen del cromatografo líquido de alta resolución AGILENT 1200
JERINGA FILTRO DE MUESTRA FILTRO Y JERINDA
Fuente: propia, 2001.Laboratorio de Control de Calidad de Medicamentos
Para realizar el experimento se recurrió un equipo de Disolución in Vitro
armado con el Aparato 1 (canastilla)
Canastillas (aparato 1)
Equipo de disolucion Pharma Test
Fuente: propia, 2001.Laboratorio de Control de Calidad de Medicamentos
750ml de HCl 0.1N en la Etapa Acida
Añadido de 250ml de Na3PO4 0.2M ajustado a pH 6.8 en la Etapa Amortiguada
37°C en ambas Etapas VELOCIDAD:100rpm
Cromatografía Líquida de Alta Resolución(HPLC)
1. 5ml filtrados (OMS .1993.Informe 33. Acapite 2.2)
Tabla que muestra los resultados del perfil de disolucion de biodisponibilidad in vitro
TIEMPO DE MUESTREO (h:min) | AREA DEL ESTANDAR | AREA DE LAS MUESTRAS | PDA(%Q) |
0 | 8290,69 | 0 | 0 |
1 | 8290,69 | 1439,97 | 51,75% |
2 | 8290,69 | 1504,38 | 54,07% |
02:15 | 8290,69 | 1565,85 | 75,16% |
02:30 | 8290,69 | 1908,41 | 91,15% |
02:45 | 8290,69 | 2010,97 | 95,57% |
03:00 | 8290,69 | 2066,69 | 97,71% |
Fuente: propia, 2001
Imagen que muestra el perfil obtenido de la biodisponibilidad in vitro
Fuente: propia, 2001
El método analítico por Cromatografia liquida de alta resolución es capaz de detectar y cuantificar al Ácido Acetilsalicílico y su producto de degrada- ción química el ácido Salicílico por lo que es válido y aceptable bajo los pará- metros que exige la Farmacopea de Los Estados Unidos (USP)
Especial agradecimiento a la Dra. María Luisa Daza Docente de la Facul- tad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas.
A la disponibilidad del Laboratorio de Control de Calidad de Medicamen- tos de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas